生物实验——抗生素微生物检定法

这一法律体系利用抗生素在琼脂培养基中的扩散效应，采用量效平行线原理的设计，通过比较标准品和供试品对接种的试验菌的抑菌圈大小来确定供试品的效价。标准品的品种、分子式和理论计算值见表2。培养基及其制备方法。培养基I蛋白胨5g琼脂15 ~ 20g牛肉膏粉3g水1000ml磷酸氢二钾3g。除琼脂外，将上述成分混合，调节pH值略高于最终pH值0.2 ~ 0.4，加入琼脂，加热融化后过滤，灭菌后调节pH值至7.8 ~ 8.0或6.5 ~ 6.6，温度100℃。培养基ⅱ蛋白胨6g葡萄糖1g牛肉膏粉1.5g琼脂15 ~ 20g酵母膏粉6g水1000ml，除琼脂和葡萄糖外，将上述成分混合，调节pH值至略高于最终pH值0.2 ~ 0.4，加入琼脂，加热溶解，过滤，加入葡萄糖溶解，摇匀，灭菌后调节pH值至7.8 ~ 8.0或6.5 ~ 6.6， 并在115℃灭菌培养基ⅲ蛋白胨5g磷酸二钾3.68g牛肉膏粉1.5g磷酸二氢钾1.32g酵母膏粉3g葡萄糖1g氯化钠3.5g水1000ml，将除葡萄糖外的上述成分混合，加热溶解，过滤，加入葡萄糖溶解，摇匀，灭菌后调节pH值至7.0 ~ 7.2，115℃灭菌30min。 ⅳ培养基蛋白胨10g葡萄糖10g氯化钠10g琼脂20 ~ 30g柠檬酸钠10g水1000ml，除琼脂和葡萄糖外，将上述成分混合，调节pH值至略高于最终pH值0.2 ~ 0.4，加入琼脂，109℃加热15min，70℃以上保温1h，然后过滤，加入葡萄糖溶解，摇匀，灭菌后调节pH值至6.0 ~ 6.2。培养基ⅴ蛋白胨10g琼脂15 ~ 20g麦芽糖40g水1000ml，除琼脂和麦芽糖外，将上述成分混合，调节pH值至略高于最终pH值0.2 ~ 0.4，加入琼脂，加热溶解，过滤，加入麦芽糖溶解，摇匀，灭菌后调节pH值至7.2 ~ 7.4，按需分装，115℃灭菌30min，趁热斜放凝固成斜面。

ⅵ培养基蛋白胨8g磷酸二氢钾1g牛肉膏3g葡萄糖2.5g酵母膏5g琼脂15 ~ 20g氯化钠45g水1000ml磷酸二氢钾3.3g，除琼脂和葡萄糖外，将上述成分混合，调节pH值略高于最终pH值0.2 ~ 0.4，加入琼脂，加热溶解，过滤，加入葡萄糖溶解，摇匀，灭菌后调节pH值至7.2 ~ 7.4，1100℃。培养基ⅶ蛋白胨5g柠檬酸钠10g牛肉膏粉3g琼脂15 ~ 20g磷酸氢二钾7g水1000ml磷酸二氢钾3g，除琼脂外，将上述成分混合，调节pH值至略高于最终pH值0.2 ~ 0.4，加入琼脂，加热融化，过滤，灭菌后调节pH值至6.5 ~ 6.6，115℃灭菌30min。培养基ⅷ酵母膏1g琼脂15 ~ 20g硫酸铵1g磷酸盐缓冲液(pH6.0)1000ml葡萄糖5g，将上述成分混合，加热融化，过滤，115℃灭菌30min。琼脂培养基蛋白胨10g琼脂15 ~ 20g氯化钠5g肉膏1000ml，除琼脂外，将上述成分混合，调pH值略高于最终pH值0.2 ~ 0.4，加入琼脂，加热融化，然后过滤，灭菌后调pH值7.2 ~ 7.4，分装，115℃灭菌30分钟，趁热斜放凝固成斜面。培养基可以用具有相同组成的干培养基代替。使用时要按照使用说明进行配制和灭菌。灭菌缓冲液磷酸盐缓冲液(pH6.0)取2g磷酸二氢钾和8g磷酸二氢钾，加水至1000ml，过滤，115℃灭菌30分钟。

磷酸盐缓冲液(pH7.8):称取5.59克磷酸二钾和0.41克磷酸二钾，加水至1000毫升，过滤，115℃灭菌30分钟。

磷酸盐缓冲液(pH10.5)为35g磷酸氢二钾，加入2ml 10mol/L氢氧化钾溶液使其达到1000ml，过滤，115℃灭菌30min。细菌悬液的制备:枯草芽孢杆菌[CMCC (B) 63501]的斜面营养琼脂培养物制成枯草芽孢杆菌悬液，接种于含有营养琼脂培养基的培养瓶中，35 ~ 37℃培养7天，革兰氏染色法涂片镜检，可见85%以上的孢子。用无菌水洗净孢子，65℃加热30分钟。根据上述方法从短小芽孢杆菌[CMCC (B) 63202]的营养琼脂斜面培养物中制备短小芽孢杆菌悬浮液。从金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面培养物[CMCC (B) 26003]中获得金黄色葡萄球菌悬液，接种于营养琼脂斜面上，在35 ~ 37℃培养20 ~ 22小时。使用时，用无菌水或0.9%无菌氯化钠溶液冲洗菌苔备用。

微球菌悬液取藤黄微球菌[CMCC (B) 28001]的营养琼脂斜面培养物，接种于装有营养琼脂培养基的培养瓶中，于26 ~ 27℃培养24小时，或采用适当方法配制斜面，用培养基III或0.9%灭菌氯化钠溶液冲洗菌衣备用。将大肠杆菌悬液接种于大肠杆菌[CMCC (B) 44103]营养琼脂斜面上，于35 ~ 37℃培养20 ~ 22小时。使用时，将菌苔用无菌水洗净备用。酿酒酵母悬浮液:将酿酒酵母(9763)的V培养基琼脂斜面培养物接种在IV培养基的琼脂斜面上。32 ~ 35℃孵育24小时，将菌苔用无菌水洗净，置于装有无菌玻璃珠的试管中，摇匀备用。标准溶液的配制、标准的使用和保存应符合标准规范的规定。使用时按照表1的规定稀释。准确称取(或量取)供试品溶液的制备，取供试品溶液适量，用每种药物项下规定的溶剂溶解，然后根据表1中的估计滴度或标记量，稀释至与标准品相当的浓度。双碟制备:取直径约90mm、高16 ~ 17 mm的平底双碟，分别注入20 ml加热融化的培养基(如表1所示)，均匀铺于碟底，置于水平台上固化为底层。另外，将适量培养基加热融化后，冷却至48 ~ 50℃(孢子可达60℃)，加入适量指定的试验菌悬液(可获得清晰的抑菌圈)。二剂量法标准溶液高浓度引起的抑菌圈直径为18 ~ 22mm，三剂量法标准溶液中心浓度引起的抑菌圈直径为15 ~ 18mm)，摇匀，每双皿加入5ml，使其均匀铺在底层作为菌层。在水平平台上冷却后，将四根或六根不锈钢管(内径6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，外径7.8±0.1mm)均匀地放置在每个双皿中(两剂法)，并用瓷砖圆盖盖上备用。

验证方法二剂量法取按上述方法制备的至少四个双盘，将高浓度和低浓度标准溶液滴入每个双盘对角的两根不锈钢管中，将相应的高、低浓度试液滴入其余两根管中；高浓度和低浓度之间的距离为2: 1或4: 1。在规定条件下培养后，测量各抑菌圈的直径(或面积)，按生物测定统计(附录ⅹⅳ)中的方法(2.2)进行可靠性试验和效价计算。三剂量法取上述方法制备的至少六个双板，将高浓度、中浓度和低浓度的标准溶液滴入每块双板间隔的三根不锈钢管中，将相应高、中、低浓度的试液滴入其余三根管中；三个浓度之间的距离为1∶0.8。在规定条件下培养后，测定各抑菌圈的直径(或面积)，按生物测定统计(附录ⅹⅳ)中方法(3.3)进行可靠性试验和效价计算。

如果用这种方法计算的滴度低于估计滴度的90%或高于估计滴度的110%，则应调整估计滴度并重试。

除另有规定外，本法的置信限率不得超过5%。