综述丨SCI TOTAL ENVIRON: 土壤微生物组在木质纤维素生物质降解中的应用前景

导读

由于涉及重要问题，使用木质纤维素生物质作为可持续生物燃料的生产技术仍在寻求其实际应用方式。无法获得有效的微生物资源来降解纤维素生物质是生物质向生物燃料生产技术转化的主要障碍之一。在这种背景下，利用微生物群降解木质纤维素生物质成为了一种快速有效的方法，可以满足生物质燃料生产技术的要求。本综述旨在探索利用土壤宏基因组技术改善木质纤维素生物质的降解过程，实现经济高效、环保的应用。土壤微生物群由丰富的微生物群落和可能存在的纤维素分解微生物组成，可采用不依赖于培养的宏基因组学方法对这些微生物进行鉴定，并可通过基因组文库进行结构和功能的探索。因此，本文还从结构和功能宏基因组学工具及其对基因组文库的贡献进行了深入的分析和讨论。此外，本综述还强调了目前存在的瓶颈及其可行的解决方案。本综述将有助于理解基于土壤微生物组介导的木质纤维素降解过程改进的基础研究和工业理念，并有可能实现低成本的商业生物燃料生产技术。

图文摘要

论文ID

原名：Prospects of soil microbiome application for lignocellulosic biomass degradation: An overview

译名：土壤微生物组在木质纤维素生物质降解中的应用前景

期刊：Science of the Total Environment

IF：10.753

发表时间：2022.9

通讯作者：Neha Srivastava

通讯作者单位：印度理工学院

DOI号：10.1016/j.scitotenv.2022.155966

综述目录

1 前言

2 木质纤维素的结构和纤维素分解混合物的作用

3 木质纤维素生物质降解的宏基因组方法

  3.1 依赖/不依赖培养的方法

  3.1 木质纤维素降解的功能和结构宏基因组

  3.2 宏基因组文库构建

4 宏基因组技术在木质纤维素降解中的应用所面临的挑战

5 结论和未来建议

主要内容

1 前言由可再生资源生产的绿色燃料能够限制全球污染问题，在保护可持续环境方面发挥重要作用，并有助于解决化石燃料的资源限制。作为一种可再生生物资源，木质纤维素含量高、可用性大、成本低，在长期可行的生物燃料生产应用中具有巨大潜力。纤维素、半纤维素、木质素和其他有机成分是木质纤维素的主要成分，其中纤维素被认为是最主要的成分，通过不同的生物加工可以转化为生物燃料。此外，纤维素的复杂结构分为无定形和晶体2种形式，需要2种特定的作用将聚合物分解为单体形式。此外，氢键、β-糖苷键以及范德华力等键的数量决定了聚合物的结构。木质素基质作为木质纤维素生物质外层，它的存在限制了生物质的转化及其通过微生物生产的生物燃料的利用。因此，木质素和其他相关抑制剂的去除是强制性的，这可以通过物理、化学或生物途径经过适当的预处理过程来实现。此外，广泛存在的微生物，特别是真菌，已被证明可直接降解纤维素和木质素。据报道，几种纤维素分解细菌具有降解木质纤维素的潜力，并可与真菌协同降解木质纤维素生物质，利用木质素衍生的芳香族化合物。多项研究证实，微生物多样性是改变整个反应过程的关键因素，且pH、温度和盐度等环境条件也受到它们的影响。因此，由这种多样性产生的微生物酶将直接影响生物燃料生产的过程。目前，商业微生物酶被用于许多工业生物过程，但该过程在经济上仍然是不可实现的。在这种情况下，微生物群的发展和来自微生物的新型生物催化剂可以帮助克服与成本相关的困难。可以长期利用的具有嗜热活性、耐热酶、适宜pH、兼性厌氧系统等特性的微生物持续且频繁的产物可能有利于开发工业规模的低成本木质纤维素生物质降解的水解酶。在不同的自然环境/生物资源中，有多种微生物产生潜在的特定酶系统。这些纤维素水解微生物能够合成各种不同的酶，如内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、d-纤维素糊精酶、纤维素生物水解酶和β糖苷酶，这些酶参与纤维素生物质的酶解，产生可发酵的糖并产生生物燃料。然而，这类微生物酶系统的主要缺点是需由特定的微生物产生特定的纤维素酶，通过利用微生物联合体生产完整的纤维素酶来有效水解木质纤维素生物质，可以解决这一问题。微生物从自然环境到适宜环境的效率损失也是特定培养依赖性过程的主要缺陷。在自然环境中，微生物培养以协同/互惠共生的方式生活，因此它们的功能效率比在单一培养或共培养形成体系转入单一合成培养基后的效率更高。因此，强烈推荐将这些微生物自然分组在一起以执行单一功能，作为改善木质纤维素降解和后续生物燃料生产的潜在方法之一。结合宏基因组学的下一代测序(NGS)应用是一种非常有用的新兴工具，可用于识别和分析各种可培养微生物的分类和功能特征，它们共同存在于土壤或木质纤维素降解的微生物组中。该技术有助于了解微生物群落，以执行单一的目标功能并改进其功能(图1)。此外，通过使用这种独立于培养的测序手段，可能会发现不可培养的微生物群，并可能进一步以高分辨率探索微生物生态学和分类多样性。通过这种技术对木质纤维素降解进行完整而密集的微生物多样性研究，被视为评估木质纤维素降解新型酶系统潜在资源的基本方法。此外，该技术的应用可以有效地探索被视为微生物多样性潜在来源的天然土壤微生物组，以提高木质纤维素降解的可能性，并开发“更绿色”的技术来生产可持续的第二代生物燃料，这可能为未来的能源危机提供可行的解决方案。

因此，本综述旨在探索如何利用微生物组实现木质纤维素生物质的有效降解，以实现可持续生物燃料的应用，使生物质转化为生物燃料的生产技术切实可行。本文还对降解木质纤维素生物质的土壤微生物基因组文库的构建和维护进行了详细分析。重点确定了能够积极参与木质纤维素生物质有效降解的常见微生物。最后，讨论了存在的主要问题和可持续的解决方案，并展望了未来的发展前景。

图1 土壤微生物群在木质纤维素生物质降解中的作用。 2 木质纤维素的结构和纤维素分解混合物的作用纤维素被认为是最丰富的线性聚合物，它是一种复杂的碳水化合物，具有高分子量。大约10,000个葡萄糖单体由β-1,4-糖苷键结合。其中，纤维素贡献最大，如天然存在的有机化合物；它在棉花和木材上所占比例分别为90%和50%。植物基纤维素；尤其是木质纤维素生物质也代表了除纤维素、半纤维素和木质素等主要成分外的一小部分灰分、可提取物、蛋白质和果胶。此外，植物的主要和次要成分可能因植物物种而异。在各种用于高能量转换的木质纤维素中评估和选择生物质时，主要聚合物成分起着关键作用。此外，木质素含量高也被认为是选择这种生物质用于糖生产的障碍。为了从木质纤维素生物质中释放糖分，应通过预处理方法有效去除木质素。已知许多已建立的预处理方法可去除LCBs中的木质素。在物理、化学、生物等多种预处理方法中；化学方法应用最广泛。在已知的各化学预处理方法中，碱预处理是工业应用中最受欢迎和最常用的方法。预处理完成后，纤维素聚合物分解为可发酵糖是生物质转化过程的关键步骤，因为纤维素聚合物由β-d-吡喃葡萄糖单元组成，该单元与β-(1,4)-糖苷键结合，20-300个纤维素链通过氢键和范德华力连接形成微粒。纤维素组分中的晶体结构在30%到80%之间，是聚合物的主要部分，其非晶态区域很难分解。通过对纤维素大分子进行x射线衍射谱分析，发现该聚合物的晶体结构规则排列，密度为1.588 g/cm3。纤维素分子的分子量较低，因为分子存在的距离较大，且排列不规则。无定形区是纤维素暴露最多的部分，在酶解反应产生可发酵糖的生物质转化过程中，首先受到纤维素水解酶的攻击。

纤维素酶是糖基水解酶(GHase)家族的成员(EC:3.2.1)，由微生物产生，降解纤维素完成水解反应释放糖，糖可进一步转化为生物燃料。这些纤维素水解酶可以裂解碳水化合物之间以及碳水化合物和非碳水化合物之间的糖苷键。纤维素酶是许多亚组分酶的混合物，如内切葡聚糖酶、纤维素生物水解酶和β-葡糖苷酶，这些酶的作用机制是底物特异性的。例如，内切葡聚糖酶破坏了聚合物的糖苷键并形成小的单体单位，而纤维素生物水解酶则破坏了纤维素的外部结构，随后将这种寡糖最终转化为糖的单体单位(图2)。溶解多糖单加氧酶(LPMOs)的应用正在发展为辅助活性(AA)酶，通过糖基水解酶(GHs)支持纤维素酶降解生物质。基于对LPMOs的严格研究，人们注意到它有可能提高纤维素酶的酶活性，因此它们是现代生物炼制商用酶混合物时的关键要素之一。LPMOs对纤维素酶活性的增强是通过在纤维素的晶体结构中引发催化缺口来实现的，这使得纤维素酶可以接近底物。虽然纤维素酶与LPMOs的活性是有效的，但同时也是复杂的，Song等人已经解释了这一点。Sepulchro等人最近报道的研究探索了光色素沉着下的底物选择可以进一步诱导LPMOs活性。据报道，光催化和特定底物H2O2和O2诱导LPMOs活性和纤维素酶的整体活性，这可能有助于提高可发酵糖的生产。目前，商业纤维素酶是通过微生物分别生产的，其中每种纤维素酶亚酶组分单独生产，这提高了酶的总体成本，并最终提高了生物燃料生产过程的成本。因此，选择和开发能高效生产纤维素酶混合物的微生物种类，可以提高生物质生物燃料生产技术的经济性。

图2 在甘蔗渣宏基因组中发现的木质纤维素降解途径及其相关酶。简化了生物质降解过程和所涉及的酶。甘蔗渣宏基因组文库中存在的酶家族以红色字体突出显示。彩色饼图显示了涉及主要细菌门不同生物质降解步骤的不同GH家族的reads数量。 3 木质纤维素生物质降解的宏基因组方法3.1 依赖/不依赖培养的方法
不同的气候条件下微生物具有广泛的代谢多样性。此外，在自然条件和适宜条件的基础上，很难培养出超出自然环境的微生物，在适宜环境中只能培养出不到1%的微生物。根据Kennedy等人的研究，可培养部分的比例仍然很低，约为0.001-0.1%。因此，即使是在如此低比例的微生物群中，商业微生物酶也可以被开发出来，这可能是成本密集型生物燃料生产过程的原因之一。在这种情况下，宏基因组分析可以作为一种强大的工具来识别附加值蛋白和木质纤维素生物质降解的基本元素。宏基因组学的应用可以探索微生物基因库的细节，这是传统微生物培养技术无法探索的。此外，独立于培养的宏基因组学技术也有助于揭示工业生物技术产品和重要的环境微生物种类。不依赖培养的技术也能够区分特定微生物产生的特定蛋白质/酶的特定作用，而依赖培养的技术无法实现这一目标。另一方面，通过这种不依赖于培养的宏基因组学对工业上重要的蛋白质和酶的特异性检测和鉴定加快了与这些产品相关的微生物产业发展。通过宏基因组学对属于糖苷水解酶(GHs)家族的木质纤维素降解酶进行了最广泛的研究。研究者利用依赖培养方法和独立于培养的宏基因组学方法研究了土壤样品中GHs的功能多样性。土壤样品宏基因组学分析表明，38.4%的酶属于GHs家族，具有重要的工业应用意义。此外，在Fang等人的研究中，从海洋微生物宏基因组库中分离出β-葡萄糖苷酶(Bgl1A)，该酶在极端环境下表现出稳定性。在Le等人的调查中，利用高通量Illumina测序仪测定了52Gbs微生物DNA的矿山土壤样品，99.69%种群被细菌物种覆盖，其中优势门变形菌门的相对丰度约为75.68%。拟杆菌门为第二大优势群落，约占总菌群的13.11%。当对这两种细菌群落进行纤维素酶生产测试时，它们呈现出4:1的比例。该研究还分析了纤维素酶的结构多样性，GH1和GH3-FN3基因被鉴定为纤维素酶组，而G43属于半纤维素酶组。这项研究对于探索木质纤维素生物质降解的微生物组和新型酶/蛋白质分析具有重要意义。

在Wilhelm等人的一项研究中，不依赖培养的宏基因组学方法已应用于土壤样品进行木质纤维素降解。结果表明，细菌菌群对木质素降解起主导作用，而纤维素降解主要以真菌菌群为主。该研究使用与扩增子相关的稳定同位素探针(SIP)和鸟枪宏基因组学方法对木质素、纤维素和半纤维素被细菌和真菌等微生物降解的情况进行了鉴定和表征。Ceballos等人关于细菌和真菌降解木质素和纤维素的研究也得出了类似的结果(图3)。这些作者总结出了独立于培养的方法-宏基因组工具，通过16S主导的细菌群落降解木质素，通过真菌微生物群降解纤维素。细菌属Talaromyces基因被鉴定为木质素降解的优势种。在de Lima Brossi等人的另一项研究中，通过PCR-DGGE谱分析对木质纤维素生物质降解进行了土壤微生物组分析，其中主要细菌菌群覆盖了总微生物数量约40%，而真菌菌群覆盖了约60%。除了微生物组分析，研究中还观察到了pH和底物的影响。微生物群落代谢被证实为底物依赖群落。表1总结了依赖培养和独立于培养的宏基因组方法的功能和结构特征比较。

表1 依赖培养和独立于培养的宏基因组方法的功能和结构特征比较。

 图3 木质纤维素降解菌群的宏基因组分析。 3.2 木质纤维素降解的功能和结构宏基因组学通过宏基因组学研究微生物源性生物分子的应用，必须实现两个目标：结构和功能宏基因组学。结构宏基因组学涉及微生物组属和种等分类学的识别，据此可以研究特定微生物组在特定生态系统、环境、生物地球化学循环和进化史中的详细生境。在功能宏基因组学中，研究微生物组的基因组多样性，以探索基因组细节、新基因、新的生物分子或酶以及新的途径。功能宏基因组学还将提供修改现有基因组途径的可能性，以改善生物分子生产，实现其广泛的工业应用。此外，功能宏基因组学已成功应用于木质纤维素降解酶新蛋白家族的分离和鉴定，例如多种纤维素酶。此外，对于结构和功能基因组学分析，最常用的2种方法是扩增子和鸟枪法宏基因组学。在扩增子赋能宏基因组学中，16S核糖体RNA被用于识别细菌和内部转录间隔区(ITS)。另一方面，通过18S分析鉴定真菌种类。16S/18S rRNA基因均显示高可变和保守序列。此外，16S探针对16S核糖体RNA基因的高可变V1-V9区域，可用来识别微生物组中不同的细菌群落。在分析16S rDNA测序数据时，97%以上的序列被划分为一个操作分类单元(OTU)，每个OTU被假定为一个类群。而与16S rRNA相似的生物被认为是一个物种，因此缺乏紧密的多样性是该方法的主要障碍。其次，ITS区域在5.8S-18S rRNA基因之间发现了广泛的变异，这有助于分析真菌的多样性。真菌的分类多样性也依赖于核糖体基因，如大亚基(LSU)或28S、小亚基(SSU)或18S和5.8S亚基rRNA基因。此外，基于扩增子的宏基因组学不能证明宏基因组的概念，因为它只解释了生物的特定区域，而不能解释存在于同一栖息地的整个微生物组，这一问题可以通过鸟枪测序方法解决。该方法包括样品采集、处理、测序和质量过滤。随后，接收到的测序reads、reads组装、contigs分箱以及接收到的数据检查。鸟枪法测序技术更适用于广阔的栖息地，如土壤样本，从广阔的栖息地获得更多新物种的机会也有所增加。鸟枪法测序的一个主要优点是，它可以直接建立宿主和微生物之间的功能关系，便于对细菌进行种水平和菌株水平的分类。然而，这种方法相对较高的成本和相关的生物信息要求使其成本较为密集。Rausch等人的研究证实了鸟枪法测序比扩增子测序更实用。此外，由于木质纤维素生物质结构的复杂性，最好通过木质纤维素材料研究木质纤维素微生物，并分析相关不可培养微生物的分解代谢效率。因此，甘蔗渣、稻草、稻壳、麦秸等环境适宜于鉴定新的木质纤维素降解宏基因组物种。Rausch等人和Reichart等人的研究中使用了一种高功能宏基因组，其中通过基因组测序在GHs家族CAZymes类别下鉴定出了高木质纤维素生物质降解酶。 3.3 宏基因组文库构建构建宏基因组文库是选择和保存潜在木质纤维素降解微生物组的最可持续的途径。然而，由于快速和高污染的问题，难以从木质纤维素组分中提取高纯度的DNA，从而构建宏基因组文库。中间酸、糠醛和酚类化合物是常见的污染物载体，容易干扰微生物DNA结构。然而，很难提取的DNA容易受到其他抑制剂如保存剂和稳定剂的影响。同时，这些DNA产量较低。由于这些问题，没有标准化的方法可以从木质纤维素生物质中提取宏基因组DNA，因此，研究人员正在整合各种各样的DNA提取方案。由于露天污染造成的微生物负荷可能是解释木质纤维素微生物组DNA产量低的最合适原因。这一问题可以通过使用纤维素基质富集培养来克服，它只允许纤维素微生物群的生长和支配，并发展出巨大的菌落用于DNA提取。此外，可以采用过滤技术分离真核和原核纤维素菌群，硅胶可以保护mgDNA免受纤维素富集培养引起的环境压力。此外，纤维素微生物的持续富集培养会改变微生物组的自然环境，因此，环境压力是自然产生的，在DNA提取法的细胞裂解过程中使用硅胶可以减轻环境压力。轻度旋转离心和软缓冲液处理是保存mgDNA的有效策略。然后，根据mgDNA文库功能筛选的目标，分离和纯化这些mgDNA后克隆到质粒、cosmids和fosmids或人工细菌染色体中。一般来说，代谢途径相关基因在微生物基因组中的操纵子或超操纵子集群中被发现，并且在原核生物中比真核生物中更常见。因此，最好将mgDNA克隆到cosmids或fosmids中进行功能筛选。此外，基因的成功表达必须在宿主中表达，才能使效果最大化。虽然使用了几种宿主，但大肠杆菌一直被认为是最好的选择之一，并主要用于经济、有效和高水平的许多异源蛋白的生产，这种宿主可能具有从宏基因组文库中分离出来的有限的木质纤维素分解酶。此外，迄今鉴定的主要木质纤维素分解酶属于原核蛋白。真核宿主系统的发展也将有助于生物质降解酶的宏基因组学研究。在Thidarat等人的研究中，构建了14个用于木质纤维素生物质降解的DNA fosmid库。其中木聚糖酶基因组12个和纤维素酶基因组2个，pH约为10。这些基因组序列的同源性为59%，相似性为73%。Fuji等人构建了Talaromyces cellulolyticu Y-94菌株的基因组草图，该菌株是一种很有前景的纤维素酶生产真菌，具有36.4 Mbp长的基因组，用于木质纤维素生物质降解。 4 宏基因组技术在木质纤维素降解中的应用所面临的挑战木质纤维素降解用于可持续生物燃料生产是最具吸引力的研究课题之一，因为它被认为是纤维素丰富的、可再生的、低成本和环境友好的生物资源，可以有效地用于增值。宏基因组学的应用有助于提高生物燃料的生产力，并可能有助于以可持续和环境友好的方式降低经济成本。尽管宏基因组学在生产附加值产品的木质纤维素降解中有巨大的需求，但该过程相对较新，面临许多挑战，需要关注其在纤维素生物质降解中的长期实际应用。依赖培养和不依赖培养的宏基因组文库构建是分别通过16S RNA和18 ITS区识别细菌和真菌群落来实现的。不依赖培养方法的主要优点之一是可以分离出传统培养依赖法难以分离的新型非特异性细菌和附加值蛋白。然而，由于非特异性微生物组的微生物负荷较大，很难获得期望的纤维素降解微生物组的特异性DNA。然而，这种方法基因组识别在70%以上时，细菌种类是相同的，并且不会发生特定的鉴定。此外，这种技术很难识别和分离高产蛋白质的高水平新基因组。因此，70%以上的高通量测序可能为新微生物物种的高产量附加值蛋白的选择提供潜在的清晰度。鸟枪法比结构宏基因组学更合适，它遵循以下步骤，如样本收集、处理、测序、质量过滤、序列reads和reads组装。为了使鸟枪技术的结果更恰当和准确，微生物菌落应更简洁并且底物更具针对性。例如，土壤微生物组应通过纤维素基质(如羧甲基纤维素)来构建和富集，这只允许纤维素微生物组的生长，并减少其他土壤微生物的微生物负荷。这一实践将有可能提高木质纤维素降解微生物DNA的质量和纯度，并有助于宏基因组文库的构建。虽然宏基因组文库是木质纤维素降解的潜在工具，但该过程存在一些特定的技术限制，例如从木质纤维素降解微生物中获得的DNA纯度、质量、数量和变性。此外，由于上述限制而缺乏标准化方法也是影响DNA分离和纯度的主要缺点。因此，通过建立木质纤维素降解的DNA分离方案可能有助于构建木质纤维素降解微生物组的基因组文库。真核宿主系统的充分发展也可能对探索木质纤维素降解酶有重要意义。真菌宿主可能促进更多的转录后、翻译后修饰、功能依赖性三级结构形成和信号肽识别/蛋白分泌，有利于探索更多的纤维素水解酶。 5 结论和未来建议本文综述了利用宏基因组学方法构建可降解木质纤维素生物质的土壤微生物群，以实现生物燃料的可持续应用。尽管木质纤维素生物质是生物燃料工业生产的最可持续的基质，但该工艺在世界范围内的广泛应用距离其实际用途还相差很远。此外，生产成本高和酶效率低是该工艺实际应用的关键瓶颈。在这种情况下，宏基因组学的实施可能是一个潜在工具，以填补其实际应用中初级到中试规模效用之间的差距。从绿色燃料生产的角度来看，土壤微生物群具有生产纤维素分解酶和附加值蛋白的多样化和新颖的微生物，是合适的潜在候选者。宏基因组学的各种方法，如独立于培养的方法、结构和功能宏基因组学和基因组文库构建，都有潜力增强有效酶和生物燃料生产过程中的木质纤维素降解作用。然而，这种潜在的方法也受到一些阻碍，如分离障碍、低产量和纯度问题，如木质纤维素降解土壤微生物组存在严重的微生物负荷。这篇综述强调了土壤微生物组处理的细节，同时，克服与该方法相关的许多问题非常必要，应该进一步探索通过该方法实现可持续和低成本生物燃料-木质纤维素生物质降解的生产技术实施。原文链接：

/science/article/pii/S0048969722030637

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