动物行为实验指南｜浅析小鼠震惊反射实验（Startle Reflex Test）的测试方法和注意事项

研究背景

感觉运动门控指的是感觉事件抑制运动反应的能力。在人类和啮齿动物中被广泛研究的一种感觉运动门控形式是惊吓的前脉冲抑制（PPI）。惊吓反射是由足够突然和强烈的刺激引起的全身肌肉组织的不自主收缩组成的。具体来说，听觉惊吓反射的特征是对一个意想不到的强烈听觉刺激的退缩反应。评估惊吓反射的前脉冲抑制（PPI）是惊吓可塑性的一种形式，其特征是当一个强烈的惊吓刺激（或脉冲）之前有一个短暂的、低强度的预刺激（或预脉冲）时，个体受到惊吓的反应幅度会正常降低。PPI通常用于评估感觉运动门控功能，它已在包括人类和小鼠在内的许多物种中被观察到。临床研究发现，精神分裂症、强迫症、图雷特综合征、亨廷顿氏病和双相情感障碍的患者均表现出PPI缺陷。此外，在精神病障碍患者中，感觉运动门控的功能缺陷与认知碎片化和精神病症状相关。由于这些缺陷在精神病患者和动物模型中都有发现，因此PPI范式在很大程度上用于神经精神疾病的研究，并已被证明是研究和描述几种抗精神病药物作用以及探索精神病样行为的机制的有效工具。

材料和试剂

1、小鼠（C57BL6/N小鼠）

注意事项：如果在PPI测试之前给药，需将药物组和对照组的动物分开饲养后进行测试。

2、70%酒精

实验设备

1.VisuStartle震惊反射装置（VisuStartle，上海欣软信息科技有限公司，型号：XR-XZ208）

2.数字声级计（FLIR系统，Extech）

VisuStartle惊吓装置：1、每个实验装置都包括一个非封闭的隔音装置，用于防止外部噪音或振动干扰实验。2、在腔室内有一个由有机玻璃（透明）组成的稳定仪固定在平台上。3、 高精度的定制传感器，传递动物运动信息，然后由计算机和接口组件转码、校正和记录。4、扬声器，根据所需的设置产生引发小鼠惊吓的声音刺激。

软件

1、VisuStartle分析软件（VisuStartle，上海欣软信息科技有限公司）

脑声常谈好物推荐丨动物震惊反射实验分析系统（startle reflex，SR）

2022-11-18

实验方案

A.设计protocol

PPI实验方案可以通过调整脉冲和预脉冲强度、试验次数、试验间隔等来修改，以探索不同的实验目标。

1.以5分钟的适应期开始训练。在适应期间，给予70分贝白噪声的持续背景噪声，该阶段目的是让实验动物适应动物支架、惊吓箱和背景噪声。

2.然后，该protocol将继续90个不同的试验（图2）：

图2|PPI测试的实验设计（前五个试验包括五个脉冲试验(A)。中间80个试验分为10块随机脉冲试验，预脉冲试验，组合预脉冲试验和无刺激试验(B)。会话结束最后连续五次脉冲试验(C).预脉冲强度（73 dB、76 dB和82 dB）高于70 dB的背景噪声即可。）

a.前5个试验包括5次单独的脉冲试验，即播放120 dB的白噪声，持续时间为20毫秒（即没有预脉冲刺激）。这些试验有助于适应和稳定动物的惊吓反应。

b.随后继续设计10个区块试验。每个区块包括一个单独脉冲试验、三个单独预脉冲试验（70 dB背景声音的标准上+3、+6或+12dB）、三个预脉冲-脉冲试验组合和一个无刺激试验（NOSTIM,即仅背景噪声）（表1）。8个试验在每个区块内以随机顺序呈现，试验间隔（ITI）应在10-30秒之间随机变化，以减少试验中动物惊吓反应的习惯化。

注意事项：

i.随机ITIs的优点是让实验动物不能预测下一个脉冲刺激出现的时间。若实验动物注意到预脉冲出现的规律将会过度抑制惊吓反应，从而引起实验误差。此外，应避免低于10秒的ITIs，以排除肌肉疲劳和肌肉反应不应期引起的影响。

ii.预脉冲的强度应保持在背景噪声之上，但也足够低到它们本身不会引起显著的惊吓反应，一般应比背景噪声高约2-20 dB。此外，对预脉冲的敏感性也可能因实验动物的品种、性别或年龄而变化。

表1|PPI使用的不同类型试验参数

试验名称

试验参数

Pulse alone trials

持续时间为20毫秒的120 dB强度的白噪声。

Prepulse trials

持续时间为20毫秒的预脉冲声音刺激（73 dB，76 dB和82 dB）。

Prepulse–pulse trials

在单独脉冲刺激开始前出现给予20毫秒的预脉冲声音刺激（73 dB，76 dB和82 dB）。

NOSTIM trials

没有刺激

c. protocol以最后一个五次连续的单独脉冲试验结束，该部分与a相同。

注意事项：脉冲刺激上升时间、持续时间和强度是影响惊吓反射幅度的变量。考虑到动物的品系、年龄、性别和遗传背景，应仔细确定所有参数，因为不同的品系对惊吓刺激可能表现出不同的反应。

B.实验步骤

1.校准扬声器和惊吓室传感器平台的灵敏度（图3）。遵循制造商的声音和运动校准指南。注意事项：声音和运动传感器的校准对于获得有效的测试结果非常重要，必须在每次实验之前进行常规校准。

图3|用于惊吓反射室校准的扬声器(A)和运动灵敏度检测器(B)

2.在创建了实验protocol（A1，A2）之后，可以使用SR-LAB惊吓装置软件创建一个研究数据库，定义实验阶段和将要被测试的受试动物。

3.把实验鼠送到试验室。可以同时测试尽可能多数量的鼠。在实验开始前，不要让实验鼠应激，为此，在实验前至少24小时内不改变家庭笼环境状态。测试室的照明和噪音水平应与室内的照明和噪音水平相当，以尽量减少环境对行为结果的影响。管状动物围栏可以最大限度地减少压力，使动物保持在传感器的中心，从而测得持续可靠的实验结果。

4.在实验阶段，将试验鼠放在测试室内的圆柱体中，并确保门关闭。

5.按照上述实验设计进行实验。实验将在protocol结束时自动停止（大约在35-40 min之后）。

6.在实验结束时，将每只实验鼠取出，放回笼子里。用水擦拭清洁动物支架和腔室，并在引入下一个实验动物之前保持干燥。

7.在屏幕上选择下一个阶段。

8.在所有的试验结束时，用70%的乙醇清洗试验设备，然后让它们晾干。将获得的数据用于后续的声音惊吓和声音前脉冲抑制反应的分析。

数据分析

在五个连续的单独脉冲试验的第一个和最后一个区块获得的反应性得分可以单独分析，以评估惊吓习惯。从其余的80个试验中获得的数据根据它们与不同的行为结构的相关性被分为三个不同的子集。

首先，惊吓反应性(S)是从单独脉冲试验中获得的反应性评分来评估的（不包括五个连续的单独脉冲试验的第一个和最后一块）。利用软件分析120 dB脉冲呈现后的100毫秒响应窗口，并利用最大响应峰值振幅来确定声音惊吓反应，作为试验动物对惊吓脉冲反应的控制指标（图4A）。

第二，相对于单独脉冲/惊吓试验(S)，预脉冲-脉冲试验（PPiS）的反应性用于评估前脉冲抑制（PPI）（图4B)。前脉冲抑制量以每种声脉冲前试验类型的百分比得分计算：

%PPI=100x（S-PPiS）/S（图4B)

第三，为了测量预脉冲引起的反应性（PP），一个正常实验结果应该显示，随着预脉冲强度的增加，PPI水平会增加，而变异性相对较低（图4C）。当使用相同的品系、性别和药物剂量时，特定药物对PPI的影响结果应该是可重复的。惊吓反应数据通常比PPI数据显示出更多的可变性和更低的可靠性。

图4|一个典型的PPI实验的预期结果（A.单独脉冲和预脉冲试验后100毫秒响应窗口的软件输出。箭头表示最大反应峰值幅度，用于确定声音惊吓反应和最大反应时间，作为动物对刺激反应的指标。B. 利用预脉冲-脉冲试验（PPiS）相对于单独脉冲/惊吓试验(S)的反应性来评估脉冲前抑制（PPI）。C. BL6N背景的野生型小鼠的前脉冲抑制百分比（%PPI），PPI水平随着脉冲强度的增加（高于背景）而增加，变异性减少。）

注意事项

1.在本文的PPI实验中，动物都被饲养在每笼4- 5只动物的集体笼中。虽然社交隔离可以改变大鼠的惊吓反应，但隔离对小鼠的惊吓反应的影响仍不清楚。因此，在惊吓实验中使用被单独饲养的小鼠所产生的结果并不理想。

2.实验方案应在上午（从上午9点到下午2点）进行。

3.品系：小鼠惊吓反射和PPI具有品系差异。

4.性别：雄性和雌性小鼠都被用于惊吓反应性和PPI的方案。如果在同一天使用，测试室的清洁过程必须要有保障，以避免异性气味对行为结果的影响。

5.年龄：年龄是在测量声惊吓和PPI方面的一个重要变量。年龄相关的听力障碍，可以改变惊吓反应性和PPI水平。此外，研究表明，与成年动物相比，早期青春期小鼠可以表现出惊吓反应性和PPI的改变。

6.不同的致精神病性药物（如大麻素、安非他明等）可作为该检测的阳性对照。