USP19通过自噬调控NLRP3功能抑制炎症和促进M2样巨噬细胞极化

巨噬细胞极化成促炎症的M1样细胞或抗炎的M2样细胞是建立宿主防御或修复组织的关键。控制这一过程的确切分子机制仍不清楚。不同的信号通路调节M1和M2样巨噬细胞极化的平衡。例如，IL-1β的产生是由多个步骤控制的，IL-1 DNA是M1样巨噬细胞极化的标志。首先，核因子-κB(NF-KappaB)的激活是原IL-1β和NOD样受体家族含3吡咯环结构域(NLRP3)转录所必需的。NLRP3在各种刺激下被激活，导致含有卡片的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的寡聚化，并重新招募前Caspase-1来成熟和释放IL-1β。而信号转导和转录激活因子6(STAT6)、Kruppellike F4(KLF4)和干扰素调节因子4(IRF4)，主导M2样巨噬细胞的抗炎反应。

泛素特异性蛋白水解酶19(USP19)是一种内质网锚定的脱泛素化酶，调节内质网相关蛋白的降解和DNA损伤修复。有证据表明，USP19通过不同的机制作为免疫反应的关键负调控因子。之前，研究人员报道了USP19稳定Beclin-1蛋白以促进自噬和抑制I型干扰素信号转导。自噬与许多细胞过程密切相关，包括宿主防御和组织修复。为了在体内充分了解USP19在调节自噬和免疫反应之间的串扰中的功能，研究人员建立了USP19基因敲除(KO；USP19−/−)小鼠，发现USP19通过促进自噬介导的反应性氧物种(ROS)的清除来抑制M1样巨噬细胞中NLRP3的炎症小体激活。

研究人员之前发现USP19通过稳定Beclin-1蛋白(由BECN1编码)来促进自噬小体的形成。为了研究USP19是否通过体内自噬调节先天免疫反应，研究人员利用CRISPR/Cas9技术建立了传统的KO小鼠。

研究人员发现，Usp19缺乏降低了骨髓(BM)细胞Beclin-1的稳定性。据报道，自噬可以诱导PAMP(病原体相关分子模式)或DAMP(损伤相关分子模式)清除，从而减轻炎症。为了揭示USP19在炎症中的作用，研究人员采用铝盐(以下简称明矾)诱导的腹膜炎模型，检测IL-1β的产生，发现USP19−/−小鼠灌洗液中IL-1β的浓度显著高于野生型(WT)小鼠(图1A)。

为了确定USP19−/− 小鼠IL-1β产量增加是否与巨噬细胞募集增加有关，研究人员对灌洗液中的巨噬细胞进行了量化。出乎意料的是，经过明矾处理的USP19−/−小鼠的巨噬细胞总数减少了(图1B，c)。因此推测USP19−/−小鼠M1样巨噬细胞和M2样巨噬细胞之间的平衡可能发生改变。研究人员发现明矾处理后USP19−/−小鼠的M2样巨噬细胞(F4/80+CD11b+MR+；图1d，e)DNA含量显著降低，而不是M1样巨噬细胞(F4/80+CD11b+CD86+；图1f)。

巨噬细胞极化与中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的募集密切相关。因此，研究人员对腹膜渗出细胞(PECs)中的中性粒细胞和嗜酸性粒细胞进行了量化，发现与WT小鼠相比，USP19−/−小鼠的明矾诱导的中性粒细胞(CD11b+Ly6G+)募集显著增强(图1g，h)。相反，在USP19−/−小鼠中，嗜酸性粒细胞(CD11b+Siglec-F+)的募集严重受损(图1i，j)。因此，这些结果表明，在明矾诱导的腹膜炎模型中，Usp19缺乏将抗炎反应转换为促炎反应。

鉴于USP19显著抑制明胶腹膜炎模型中IL-1β的产生，研究人员认为USP19可能调节炎性小体的激活。研究人员从USP19−/−小鼠分离了不同类型的细胞，并检测炎性小体的激活情况。据报道，NLRP3可以激活炎性小体，而NLRP3的缺失会抑制IL-1β的分泌。因此，研究人员用三磷酸腺苷、明矾和二氧化硅处理细胞来激活NLRP3介导的IL-1β的分泌，发现Usp19的缺失显著增加了骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)、骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)和小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中的IL-1β的释放，而聚(da：dt)(一种AIM2炎症体激活剂)诱导的IL-1β的分泌基本上保持不变(图2a)。USP19已经被报道通过靶向TLR3/4信号来特异性地调节NF-κB信号。研究人员将R848(TLR7/8配体)和PGN(TLR2配体)应用于研究人员的系统来诱导炎性小体激活，观察到USP19缺乏增加IL-1β的产生。因此，除了USP19在TLR3/4信号转导中的作用外，研究人员的数据支持USP19也针对炎症体激活并影响炎症反应的概念。此外，研究人员检测了caspase-1的切割，并发现与WT小鼠相比，经三磷酸腺苷处理的USP19−/−小鼠BMDM上清液中切割的caspase-1数量增加，表明USP19缺乏确实增强了NLRP3炎症体的激活(图2B-d)。

研究人员还证实，USP19的缺失增加了人THP-1来源的巨噬细胞中NLRP3炎症体的激活。小干扰RNA介导的USP19沉默导致内毒素诱导的THP-1来源的巨噬细胞中对NLRP3炎症体激动剂的反应增加了IL-1β的释放，与干扰对照siRNA转染的巨噬细胞相比。在炎症体激活过程中，NLRP3通过PYD-PYD介导的相互作用触发ASC斑点的形成。在USP19-KO THP-1细胞中，脂多糖诱导和ATP攻击的THP-1来源的巨噬细胞的ASC斑点形成显著增加，以响应炎症小体的激活(图2e，f)。激活的caspase-1裂解Gasdermin D蛋白以驱动一种称为焦磷脂的炎性细胞死亡。研究人员接下来评估了USP19在ATP、明矾、二氧化硅和聚(da：dt)诱导的细胞死亡中的作用。在NLRP3炎症体激活时，USP19−/−细胞的细胞死亡比WT细胞更显著，但没有观察到由于AIM2介导的炎症体激活的差异(图2g)。为了进一步证实USP19抑制NLRP3炎症体的激活，研究人员使用siRNAs敲除了WT和USP19-KO THP-1来源的巨噬细胞中内源性的Nlrp3，发现NLRP3的缺失抑制了USP19-KO细胞对内毒素和三磷酸腺苷的反应中IL-1β的上调。综上所述，这些结果表明，USP19缺乏特异性地增强了NLRP3炎症体的激活和细胞死亡。

此外，研究人员没有观察到WT和Usp19缺陷细胞之间IRF4 mRNA水平的太大差异。研究人员观察到USP19的过表达增加了NLRP3稳定表达的人胚胎肾脏(HEK)293T细胞(称为HEK293T-NLRP3细胞；图4B)中IRF4的蛋白水平。由于IRF4 mRNA不会随着USP19的过度表达而改变，因此IRF4丰度的增加发生在蛋白质水平(图4B)。为了确定IRF4的哪个结构域被USP19稳定，研究人员将Myc-USP19与HEK293T-NLRP3细胞共转染，并标记了IRF4的截短突变体。免疫印迹分析表明，USP19稳定了IRF4的C-末端和N-末端结构域。

有趣的是，研究人员发现USP19介导的IRF4的稳定完全被自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)、自溶酶体抑制剂氯喹(CQ)或氯化铵(NH4Cl)，以及蛋白酶体抑制剂MG132、乳胞素和卡废佐米(图4C，d)抑制。这些结果表明，USP19通过阻断自溶酶体或蛋白酶体途径来稳定IRF4。此外，研究人员将BM细胞置于自噬诱导条件下，包括饥饿和雷帕霉素处理，发现IRF4蛋白水平降低。

相比之下，自噬抑制剂巴菲罗星、图巴菌素和CQ阻止了IRF4的降解。15研究人员研究了IRF4与不同的Cargo受体的相互作用，发现IRF4与p62特异地相互作用，但不能与Nip3样蛋白X(Nix)、Optineurin(OPTN)、BRCA1的邻居(NBR1)、Tollip或核点10蛋白52(NDP52；图4E)相互作用。

进一步的实验表明，IRF4不与自噬过程中的其他关键蛋白结合，包括UNC-51的成员，如自噬激活蛋白1复合体、Beclin-1复合体、自噬相关的5-12(ATG5-12)或ATG7。此外，研究人员还发现在NH4Cl存在下，IRF4与LC3B共定位。这些数据表明，IRF4是通过Cargo受体p62被招募到自噬小体中的。进一步的免疫沉淀分析表明，IRF4的C末端负责IRF4-p62的相互作用。接下来，研究人员剖析了USP19在IRF4稳定中的机制，发现USP19的过表达损害了IRF4-p62的结合。同样，在BM细胞中，研究人员也检测到p62和IRF4的内源性关联，并发现Usp19缺乏显著增强了p62和IRF4之间的关联(图4F)。

最后，研究人员发现USP19不能进一步稳定p62缺失细胞的IRF4蛋白（图4g）。此外，研究人员在USP19−/−BM细胞中重新表达了小鼠IRF4，并观察到小鼠IRF4的重新表达恢复了IL-4诱导的USP19−/−BM细胞中M2样巨噬细胞的极化(图4H，I)。总之，这些发现表明，USP19通过阻止IRF4的p62介导的选择性自噬降解来促进类M2巨噬细胞极化。

为了研究USP19如何阻止p62介导的IRF4降解，研究人员研究了USP19是否通过直接相互作用影响IRF4的稳定性，没有检测到USP19和IRF4之间的相互作用，这意味着USP19在稳定IRF4方面是间接的(图5A)。

最近有报道称NLRP3通过与IRF4的协作与哮喘有关，而类M2巨噬细胞极化紊乱是哮喘的主要原因。因此，研究人员检查了NLRP3在M2样巨噬细胞极化中的作用，并观察到NLRP3缺乏降低了M2样巨噬细胞的比例，并减少了中性粒细胞对甲壳素的募集。

小鼠NLRP3在Nlrp3−/−BM细胞中的重新表达恢复了IL-4诱导的M2样巨噬细胞极化。研究人员进一步证实，在IL-4刺激BM细胞后，IRF4与NLRP3结合，IRF4的N末端对IRF4-NLRP3的结合至关重要(图5B)。Usp19缺乏通过影响NLRP3和IRF4的降解率降低了NLRP3和IRF4的蛋白质水平(图5C)。研究人员发现NLRP3的敲除可以显著减少USP19诱导的IRF4积聚(图5D)。综上所述，这些数据表明NLRP3可能在USP19介导的IRF4稳定中发挥重要作用。

由于在WT和USP19−/−细胞中NLRP3和IRF4的蛋白水平相似，研究人员假设NLRP3与IRF4的积累有关。研究人员首先收集了几丁质处理的WT和Nlrp3IRF4 PECs，发现Nlrp3缺乏消除了−/−的积累(图5e)。异位表达的NLRP3显著增加了IRF4的积累。此外，研究人员进行了CHX“Chase”分析，证明Nlrp3缺乏加速了内源IRF4的降解速度(图5F)。接下来，研究人员发现自溶酶体抑制剂3-MA、CQ和NH4Cl单独使用可以稳定IRF4，而NLRP3的加入并不能进一步稳定IRF4。然而研究人员在用蛋白酶体抑制剂MG132治疗时没有观察到这样的效果(图5G)。

研究人员进一步证明，NLRP3不能进一步增加BECN1-KO细胞中IRF4的蛋白水平，在BECN1-KO细胞中，自噬严重受损(图5H)。由于IRF4只与p62(图4D)相互作用，研究人员研究了IRF4、NLRP3和p62之间的相互作用。研究人员的数据表明，外源NLRP3取消了IRF4-p62的相互作用。Nlrp3缺乏显著增加了IRF4-p62对IL-4的反应，这一发现进一步证实了这一观察结果(图5I)。最后，研究人员表明NLRP3不能进一步增加SQSTM1KO HEK293T细胞中IRF4的蛋白水平(图5J)。总之，这些数据表明，NLRP3通过阻断IRF4-p62的相互作用来抑制IRF4的降解。

为了进一步确定USP19稳定NLRP3蛋白的分子机制(图5C)，研究人员研究了它们之间的直接相互作用。在BM细胞中，内源性USP19和NLRP3直接相关，但它们的相互作用因炎症体激活而减少(图6A)。这些数据表明，NLRP3整合到M1样巨噬细胞的炎性小体中会降低其与USP19的结合，因此研究人员推测，未被整合到炎性小体中的NLRP3可能与USP19结合并促进M2样巨噬细胞极化。事实上，NLRP3R260W突变体是NLRP3的一种活性形式，可以在没有刺激的情况下直接触发IL-1β的分泌，与WT NLRP3相比，其结合USP19的能力降低(图6B)。

Fig6

因此，USP19不能稳定NLRP3 R260W突变体(图6C)。

此外，通过与USP19共表达NLRP3和截短的NLRP3结构域，研究人员发现NLRP3的LRR结构域主要与USP19相互作用。此外，研究人员还检测到USP19与NLRP3的Nacht结构域之间存在弱关联，该结构域包含R260。为了确定USP19如何稳定NLRP3蛋白，研究人员应用了蛋白酶体和自溶酶体抑制剂，发现USP19介导的NLRP3积累在蛋白酶体抑制剂MG132、lactacystin和carfilzomib存在的情况下被取消，但不能在自溶酶体抑制剂3-MA或CQ的存在下被取消(图6d，e)。此外，研究人员进行了CHX“chase”分析，证明Usp19缺乏降低了内源NLRP3的稳定性，但这种表型可以被MG132处理减弱。这些发现共同表明，USP19直接与没有结合到炎症体中的NLRP3结合，并抑制其蛋白酶体的降解。

研究人员发现泛素特异性蛋白水解酶19(USP19)作为一个抗炎开关，抑制炎症反应，促进M2样巨噬细胞极化。USP19通过增加自噬通量和减少线粒体活性氧的产生来抑制NLRP3炎症体的激活。此外，USP19通过切割非炎症体非依赖性NLRP3的多泛素链来抑制其蛋白酶体的降解。USP19稳定的NLRP3通过与干扰素调节因子4直接结合促进类M2巨噬细胞极化，从而阻止其p62介导的选择性自噬降解。与这些观察结果一致的是，与野生型小鼠相比，Usp19−/−小鼠对明矾和甲壳素注射的反应是M2样巨噬细胞极化降低，白细胞介素1β分泌增加。因此，研究人员发现了一种意想不到的机制，即USP19将NLRP3的促炎功能转换为抗炎功能，并提示USP19是炎症干预的潜在治疗靶点。

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