仪器分析——分子排阻色谱法

分子排阻色谱是一种根据分子大小分离分子的液相色谱技术。分子排阻色谱的分离原理是凝胶柱的分子筛机理。色谱柱大多填充亲水性硅胶、凝胶或改性凝胶，如葡聚糖凝胶Sephadex和聚丙烯酰胺凝胶Sepherose等。这些填料在其表面上分布有不同的孔径。药物分子进入色谱柱后，其中不同的成分根据大小进入相应的孔径。大于所有孔径的分子不能进入填料颗粒，也不能保留在色谱过程中。它们最早被流动相从柱中洗脱出来，显示出较短的保留时间。小于所有孔径的分子可以自由进入填料表面的所有孔径，在柱内停留时间较长，表现为停留时间较长。剩余的分子根据分子大小依次洗脱。

1.资料来源:考试大学

分子排阻色谱所需的进样器和检测器与高效液相色谱相同，液相色谱泵一般分为常压、中压和高压。高效排阻色谱法(HPSEC)通常用于药物分析，尤其是分子量或分子量分布分析。应选择适合样品分子大小的色谱柱填料。所用的流动相通常是水溶液或缓冲溶液，溶液的pH值不应超过填充剂的耐受范围，一般pH值在2 ~ 8范围内。流动相中可引入适量的有机溶剂，但不宜过浓，一般不超过30%，流速不宜过高，一般为0.5 ~ 1.0 ml/min。

2.系统适用性测试

在高效排阻色谱的系统适用性试验中，色谱柱的(1)理论塔板数(n)、(2)分离度、(3)重复性和(4)拖尾因子的测定方法一般与高效液相色谱下的相同。但在高分子杂质检查时，当某些药物分子的单体和二聚体不能与基线分离时，分离度的计算公式为:

除非另有规定，分离度应小于2.0。

3.测定方法

(1)分子量的测定

根据每个品种下规定的方法，蛋白质多肽的分子量测定是普遍适用的。除非另有规定，应选择分子大小合适的色谱柱和分子量范围合适的对照品。对照品和供试品都要用二硫苏糖醇(DTT)和十二烷基硫酸钠(SDS)处理，打开分子内和分子间的二硫键，使分子的构型和构象趋于一致。处理过的蛋白质和多肽分子通常是线性分离的。标准曲线的线性回归方程logmw = a+b tR是通过对照品的分子量(mw)与相应保留时间(tR)的对数比较得到的，样品的分子量或亚基分子量由标准曲线与保留时间的回归方程计算得到。

(2)生物聚合物的分子量和分子量分布的测定

大分子聚合物，如多糖、多核苷酸、胶原蛋白等，具有分子大小不均匀的特点，因此生物大分子的分子量和分子量分布是控制这些产品的关键指标。在测定生物高分子的分子量和分子量分布时，选择与样品具有相同或相似分子结构和性质的对照物质是非常重要的。

按照各品种项下规定的方法，除另有规定外，对照品的重均分子量(MW)的对数和相应的保留时间(tR)也用分子量对照品和适当的GPC软件制备，得到标准曲线的线性回归方程logMW=a+btR。通过适当的GPC软件处理测试样品的结果，并根据以下公式计算测试样品的分子量和分子量分布。

Mn=∑RIi/∑(RIi/Mi)

MW=∑(RIiMi)i/∑RI

d =毫瓦/毫瓦

其中Mn是数均分子量；

MW是重均分子量；

d是分配系数；

Ri是保留时间I时样品的峰高；

Mi是保留时间内测试产品的分子量。

(3)聚合物杂质的测定

高分子杂质是指药物中分子量大于药物分子的杂质，通常是在药物生产或储存过程中产生的聚合物和在生产过程中未除去的、可能引起过敏反应的高分子物质。

分离是在各种文本规定的色谱条件下进行的。

定量法

①主成分自身对照法同HPLC项下规定的方法。一般用于聚合物杂质含量低的品种。

②面积归一化方法与HPLC项下规定的方法相同。

③除非另有规定，限度法规定不得检出保留时间小于对照品的成分，一般用于混合物中高分子物质的控制。

④在SephadexG-10凝胶色谱系统中，β-内酰胺类抗生素大分子杂质的检查一般采用自身对照外标法。在该分离体系中，除部分低聚物外，β-内酰胺类抗生素中的大分子杂质在色谱过程中不被保留，即所有大分子杂质均呈单一色谱峰，以药物本身为对照品，用外标法计算药物中大分子杂质的相对百分含量。

[注意]葡聚糖凝胶-10的处理方法。

在填充色谱柱之前，将约15g的SephadexG-10浸泡在水中48小时，使其充分溶胀，搅拌除去空气泡，慢慢倒入玻璃柱中，一次性填充。然后，用水冲洗附着在玻璃管壁上的SephadexG-10，使色谱柱变平。新装填的色谱柱应连续用水冲洗4 ~ 6小时，以排出柱内的气泡。

可以用自动进样阀进样，也可以直接将样品加到床面上(此时先将床面上的流动相吸干，样品溶液沿色谱管壁一圈一圈慢慢加入。注意不要翻起填充物，在重力作用下渗入固定相后，沿色谱管壁慢慢加入3 ~ 5ml流动相，洗去残留在色谱管壁上的样品溶液)。