实时荧光定量PCR是什么

实时荧光定量聚合酶链反应是一种用荧光化学物质在DNA扩增反应中测量每个聚合酶链反应循环后产物总量的方法。通过内部参考或外部参考对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析。

实时荧光定量聚合酶链反应是一种用荧光化学物质在DNA扩增反应中测量每个聚合酶链反应循环后产物总量的方法。通过内部参考或外部参考对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析。

实时荧光检测是在聚合酶链反应扩增过程中，通过荧光信号实时检测聚合酶链反应的进展。在PCR扩增的指数期，模板的Ct值与模板的初始拷贝数呈线性关系，因此成为定量依据。

原则

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，最后用标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

检测方法

1.sybr green ⅰ法:

在聚合酶链反应体系中，加入过量的SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性掺杂到DNA双链中，然后发出荧光信号，而未掺杂到链中的SYBR染料分子不发出任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与聚合酶链反应产物的增加完全同步。

SYBR定量聚合酶链反应扩增荧光曲线

聚合酶链反应产物的解链曲线(单峰图显示了聚合酶链反应扩增产物的唯一性)

2.TaqMan探测方法:

探针完成后，报道基团发出的荧光信号被淬灭基团吸收；在聚合酶链反应扩增过程中，Taq酶的5’-3’外切酶活性消化探针，将报告荧光团与淬灭荧光团分离，使荧光监测系统能够接收到荧光信号，即每条DNA链扩增后，形成一个荧光分子，实现了荧光信号积累与聚合酶链反应产物形成的完全同步。

服务流程/程序

1.客户认真写好订单，提供待检测基因的相关信息；

2.签订技术服务合同并支付预付款(30-50%)；

3.设计合成定量PCR引物(或委托我司合成客户提供的引物)；

4.DNA/RNA;的提取、定量和核糖核酸逆转录

5.PCR预实验，主要检测引物的特异性和扩增效率；

6.形式定量实验:所有样品在电脑上测试；

7.分析实验结果和数据，形成报告。

收费标准

优惠总价:120元/样品/基因(SYBRgreenI法，相对定量)

(包括RNA提取、反转录、引物合成、计算机测试的费用(3次重复)；一个内部参考是自由的(重复三个内部参考)

技术原理

将荧光素标记的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性、低温复性、合适温度延伸的热循环，观察聚合酶链反应规律。与模板DNA互补的Taqman探针被切断，荧光素在反应体系中是游离的，在特定的光激发下发出荧光。随着循环次数的增加，扩增的目的基因片段呈指数增长。Ct值可通过实时检测随扩增而变化的相应荧光信号强度获得，标本靶基因的拷贝数可通过使用几个已知模板浓度的标准样品作为对照获得。

Ct值

Ct值(循环阈值)的含义是每个反应管中的荧光信号达到设定阈值时的循环次数

图1

(如图1所示)。

1.荧光阈值的设置

前15个循环的荧光信号作为荧光背景信号，荧光阈值默认设置为3-15个循环荧光信号标准差的10倍，即阈值= 10*SDcycle 3-15

2.CT值与初始模板的关系

每个模板的Ct值与模板初始拷贝数的对数呈线性关系，公式如下。

CT =-1/LG(1+Ex)* LGx 0+LGn/LG(1+Ex)

n为扩增反应的循环次数，X0为初始模板量，Ex为扩增效率，n为荧光扩增信号达到阈值强度时的扩增产物量。

初始拷贝越多，Ct值越小。使用已知初始拷贝数的标准曲线，横坐标代表初始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，就可以从标准曲线计算出样品的初始拷贝数。

荧光化学物质

实时荧光定量聚合酶链反应中使用的荧光物质可分为两种:荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下:

1.TaqMan荧光探针:在PCR扩增过程中，加入一对引物和特异性荧光探针，探针为寡核苷酸，探针两端分别标记有报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完成后，报道基团发出的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增，Taq酶5 & # 8217；-3’核酸外切酶的活性通过酶切降解探针，将报道荧光团与淬灭荧光团分离，使荧光监测系统可以接收到荧光信号，即每一条DNA链被扩增，形成一个荧光分子，荧光信号的积累与PCR产物的形成完全同步。然而，新的TaqMan-MGB探针使该技术能够同时分析基因定量分析和基因突变(SNP)，有望成为基因诊断和个体化药物分析的首选技术平台。

2.SYBR荧光染料:在PCR反应体系中，加入过量的SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性掺入DNA双链后，发出荧光信号，而未掺入链中的SYBR染料分子不会发出任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR只与双链DNA结合，所以PCR反应是否特异可以通过溶解曲线来确定。

3.分子信标:它是一种茎环双标记寡核苷酸探针，在其5和3端形成约8个碱基的发夹结构。两端核酸序列互补配对，导致荧光基团和淬灭基团非常接近，不会产生荧光。PCR产物生成后，在退火过程中，分子信标的中部与特定的DNA序列配对，荧光基因和淬灭基因分离产生荧光。

传统定量聚合酶链反应

1.传统定量聚合酶链反应方法简介

1)内标法:在不同的PCR反应管中加入定量内标和引物，通过基因工程合成内标。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。当模板被扩增时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标和靶模板长度不同，其扩增产物可通过电泳或高效液相分离，并可分别测定其荧光强度，内标可作为对照对待测模板进行定量。

2)竞争法:选择一个外源竞争模板，该模板具有突变克隆产生的新的内位点。在同一反应管中，用同一对引物(其中一个是荧光标记的)同时扩增待检测样品和竞争模板。扩增后，用核酸内切酶消化聚合酶链反应产物，竞争模板的产物被消化成两个片段，而待测模板未被消化。两种产物可通过电泳或高效液相色谱分离，分别测定荧光强度，从已知模板中推断未知模板的初始拷贝数。

3) PCR-ELISA法:使用地高辛或生物素标记的引物，将扩增产物与固相平板上的特异性探针结合，然后加入抗地高辛或生物素酶标记的抗体-辣根过氧化物酶偶联物，最后酶使底物显色。常规的PCR-ELISA只是定性实验。如果加内标，做标准曲线，也可以实现定量检测。

2.内标在传统量化中的作用

因为传统的定量方法都是终点检测，也就是PCR达到平台期后检测，但是当PCR经过对数扩增达到平台期后，检测的重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上重复96次，结果相差很大，无法从最终产物量直接计算出初始模板量。加入内标后，可以部分消除最终产品定量带来的不准确性。但即便如此，传统的定量方法也只能算是半定量和粗略的定量方法。

3.内标对定量聚合酶链反应的影响

如果将初始拷贝数已知的内标加入到待测样品中，PCR反应会变成双重PCR，双重PCR反应中两个模板之间会有干扰和竞争，尤其是两个模板的初始拷贝数相差较大时，竞争会更加明显。但由于待测样品的初始拷贝数未知，无法添加合适数量的已知模板作为内标。正是因为这个原因，传统的定量方法只是一种半定量的方法，虽然加入了内标。

实时荧光定量聚合酶链反应

实时荧光定量聚合酶链反应技术有效解决了传统定量只能检测终点的局限性，实现了荧光信号强度在每个周期检测一次，并记录在计算机软件中。通过计算每个样品的Ct值，根据标准曲线获得定量结果。因此，无内标实时荧光定量聚合酶链反应有两个基础:

1)Ct值的重现性PCR循环在达到Ct值的循环数时刚刚进入实指数扩增期(对数期)，此时还没有放大微小的误差，所以Ct值的重现性极好，即同一模板在不同时间扩增或在不同试管中同时扩增时得到的Ct值是恒定的。

2)Ct值与初始模板的线性关系由于Ct值与初始模板的对数存在线性关系，未知样本可以用标准曲线定量确定。因此，实时荧光定量聚合酶链反应是一种使用外部标准曲线的定量方法。

与内标法相比，外标法是一种准确可靠的科学方法。采用外标曲线的实时荧光定量PCR是目前为止最准确、重复性最好的定量方法，在基因表达研究、转基因研究、药物疗效评价、病原体检测等领域得到了全世界的认可和广泛应用。

实时荧光定量聚合酶链反应的定量方法

在实时时钟中，有两种模板量化策略，相对量化和绝对量化。

相关应用

临床疾病诊断

肝炎、艾滋病、禽流感、结核病、性病等传染病的诊断和疗效评价；地中海贫血、血友病、性别发育不良、智力低下综合征、胎儿畸形等产前产后护理检测；检测肿瘤标志物和肿瘤基因，实现肿瘤疾病的诊断；通过基因测试诊断遗传病。

动物疾病检测

禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门氏菌、大肠杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等。炭疽杆菌。

食品安全

乳品企业食源性微生物、食品过敏原、转基因、阪崎肠杆菌检测。

科学研究

与医学、农业、畜牧业、生物学相关的分子生物学定量研究。

应用行业

各级医疗机构、高校和科研院所、疾控中心、检验检疫局、兽医站、食品企业和乳品厂等。

QPCR是一种实时定量检测病原病原体基因核酸的方法，因此它比化学发光、时间分辨、蛋白质芯片等免疫学方法具有更独特的优势。

关于名字

根据miqe(发布定量实时聚合酶链反应实验的最低信息)的指南，qPCR是定量实时聚合酶链反应的简称。RT-qPCR指的是逆转录-qPCR，RT-PCR只是用来表达逆转录聚合酶链式反应，而不是实时PCR，但少数作者并不坚持这个原则。