朱健康组CRISPRCas9女博士后逆袭之路，不是每条路都洒满阳光!

不是每一条CRISPR/Ca9的路，都洒满阳光。

作者研究方向：CRISPR/Cas9在拟南芥多基因编辑中的应用

致谢全文如下（未改动）：

      六年半以前，不知是巧合还是宿命，感谢热情美好的李潇师姐牵线搭桥，我来到了山青水秀的重庆，跪投缙云，拜师学艺，从此步入了探索者的玫瑰园。淘气的我这儿看看，那儿瞧瞧，一年半了还仅是在各条小径徘徊——偶尔踮脚张望却不辨青红。还好夏老师、赵老师、年轻老师们和我们几个总是围坐一团，幸福快乐的听我们夏老师“讲故事”……不知不觉中，我也能完成老师布置的一年看懂10 篇高水平文章的要求。借机文献分享，深吸一口气，我捧起了那年春天总是被老师提起的“传说中的基因组编辑”——谁曾想它竟然是属于我的那道绿光，于随后的日子一次次的碰撞着黑暗最终燃亮了玫瑰园的整片天空。

      It’s not a tale. It’s our TALE. 那是个异常炎热的夏天，我索性在地下室看了整整一个月基因组编辑文献：应接不暇的系列精彩文章取代了高潮迭起的美剧大片，说不清到底是陶醉还是沉陷……感谢严谨而慷慨的 Cornell University 的 Adam J Bogdanove 教授，仅在我们两轮邮件往来之后，他就馈赠了整套 TALEN 质粒，并且在他的指点与批评下，我和师弟王峰历时两个月成功组装出迄今为止我见过的最难构建的载体。但是幼儿园水平的我对如何借助 TALEN 开展研究却怎么可能有概念呢，这时一个熟悉的名字再次出现——Jian-KangZhu，没错正是抗旱胁迫和表观遗传学研究领域的那个大牛朱健康教授。按照夏老师的指示，学习 Zhu Lab 的文章，在马三垣师兄和王峰师兄的共同帮助下，依葫芦画瓢我们在烟草中开始了尝试。期间遇到具体问题时，朱老师也或邮件或电话的给予帮助。之后学校联合培养的项目我便顺理成章的成功申请了朱老师的实验室，并有幸到他上海的实验室开展前期的学习研究，希望对推进我们的实验有所帮助，夏老师也对我的决定给予了最大程度的告诫与支持。即使在上海，基因组编辑也是全新的领域，起初仅有朱老师的另外一位博士生和我做相关工作，不过幸运的是，最牛的拟南芥研究团队是我们的智囊团，而且朱老师每次从美国回来都会对我俩悉心指点——从后顾之忧的安抚到植物播种浇灌、目的基因的选择。随着三位博后的加入，真正的科研赛跑开始了，期间有幸结识了基因组编辑的先驱杨兵老师，并首次尝到了Zhu Lab 的节奏。时间过得很快，完成首批 TALEN 的载体组装与转化，前往美国的日子这就来了，我心中虽有希冀，却畏惧踟蹰，回到重庆正式出发的前一晚赵老师、夏老师为我壮行，席间叮嘱告诫，如今依旧历历在目。

       耀眼的阳光、厚厚的云彩、别致的小屋，大农村是与国内有些不同。多谢Becky、王鹏成师兄、赵杨师兄、姜春晖师兄、王邦兴师兄，小伙伴月茹、唐凯、邢璐、王新刚，老同学张雁北、杨楠、于陆佳、王哲、杨雪娇、井然、耿可、陈沁的关照帮助，新生活的适应过程是新奇而又美好的。很快我也有了自己的第一辆二手车 Nissan Altima 2011，感谢它为我购物代步深夜护航，更重要的是从此我的世界便大了一些再大一些，加入了击剑俱乐部，结识了一帮热情、有主见、追求自由的朋友，我不仅仅成为了一名 fencer，而且击剑改变了我的生活，感谢Cedirc、 Cesare、Elizabeth、Tiago、Brandon、Steven、Josh，还有你 Chris，与你相遇，很幸运，很开心。

       可实验的进展就没有那么顺遂了，TALEN 在拟南芥中的尝试并不被看好，而我能做的只有努力和等待。在上海同样进展缓慢的情况下，2012 年圣诞节前夕，英明的朱老板把我派到了 Iowa StateUniversity 杨兵老师那里。一个半月时间，对基因组编辑理解深刻的杨兵老师在 TALEN 的实验操作上对我手传心授，感谢其夫人刘波老师对我的鼓励帮助，在他实验室的那段时光我真的“乐不思蜀”，并在染色体结构是否影响 TALEN 的结合、用 TALEN 同时敲除多个 PYLs 家族成员两个课题上有了一定的进展。

      技术的更迭是有益和必然的，然而对于研究开发的个人来讲，接受起来还真不太容易，尽管看到了 CRISPR 系统在植物中多基因敲除的优越性，并在与朱老师和颜军师兄的讨论中提出了借鉴TALEN 组装方法共转多个 gRNAs 的方案，但孱弱且背负毕业压力的我直至 2013 年 6 月对 CRISPR 在植物中的应用并没有做实质性的具体实验。在上海、普渡两个实验室务实畏难情绪高涨，多基因敲除课题搁置不前的时候，朱老师正确而有魄力的叫停了我的所有实验，责令我用三天时间阅读理清文献，之后立即开展 CRISPR 实验——我现在还清楚的记得那三天嘴里苦苦的味道。之后一方面接过毛妍斐师姐改造的载体，分别以拟南芥渗透胁迫和基因沉默相关的三个家族为目标基因从头设计进行多基因敲除的尝试，另一方面借鉴Multisite-Gateway 组装体系优化 CRISPR/Cas9 多基因组装体系用于多基因敲除。

      随后，由于张海荣老师的协助分担，张慧明师兄的加入和 Avtar Krishan Handa 教授实验室番茄转基因平台支持，我还着手开展了基因编辑在番茄中的尝试。不问结果，有的只有过于无奈、无力而全力以赴的努力和坚持。还要再次感谢雷“叔叔”雷明光、邦兴大哥、“同桌”新刚、Satendra、杨玉，感谢你们的理解与帮助。

      那是一段异常纯粹的时光：依旧披星戴月，而后“不见天日”，然后晚餐两个月吃同款 BLT 三明治都想不起来换，长时间紧绷的神经每天两杯特浓咖啡渐渐的让我失去了短时记忆，我用笔用手机记下要做的每件事，后来与父母几乎失去了联系……最后竟然如此幸运，终于赶上了时间的追逐和朱老师的期许。感谢朱老师的部署，感谢赵杨师兄、赵春钊师兄、王鹏程师兄、高瑾慧老师的帮助，正是他们的帮助和鼓励让我在回国前完成了 PYL 多基因敲除的 T1 代检测。回国在即， 尽管实验结果和文章成稿攥在手中，文章尚未发表，心中的感觉不只是遗憾。

       感谢老同学方嘉明、刘鹏飞、王钟晓，多年后我们在哈佛重逢，你们眼中闪烁的是阔别已久的 真诚与力量，你们的经历让我明白适时的调整与放弃恰恰是坚 守理想中最重要的一部分。但是怎样实践去扭转这窘迫的现状，唤醒疲惫的身心，我、我的朋友、一直关心帮助我的长辈、甚至我的父母，尽管多次尝试，却无能为力。当我躺在床上一个月都爬不起来的时候，才第一次明白疲惫虚弱的身体是不可能拥有勤劳的灵魂的……当我带着泥点子含着泪水回到重庆的时候，亲爱的夏老师、赵老师为我洗尘，在夏老师的教导帮助下一步步走出困境，重塑自我 ——跋山涉水、磕磕碰碰之后，我终悟咫尺西天，师恩如山，无以为报。——于 我，是修行，更是眷顾。

       感谢恩师的启蒙和栽培，使我有机会参与到烟草基因组重大专项的研究工作并得到锻炼；感谢夏老师和朱老师的信任，让我“以赛代练”加入团队开展了从 第一代基因组编辑 TALEN 到全基因组敲除的 CRISPR 基因组编辑技术开发研究工 作；更感谢他们给予的平台保证，从重庆大学到普渡大学，再到中科院上海植物 逆境中心，最终回归家蚕功能基因组团队，使我能够跟随技术发展需要工作学习。

       一路走来，竟然有幸在这么多单位学习生活，首先要感谢生命科学学院的各位老师。感谢白强书记的关怀、鼓励，感谢张泽教授的鞭策、提点，感谢高定伦 老师的耳提面命，感谢邱荣富书记、李正国院长让我体会到了三年后重回生科院 如家般的温暖，感谢余泉友老师、董攀老师、刘婷婷老师、舒慧老师、王李亚老师、贺雨老师的帮助。祝老师们工作顺利、好人一生平安！

       郑重感谢指导陪伴我们的三位年轻老师王根洪老师、程廷才老师、段军老师。感谢陪伴我一起成长的烟草小组的伙伴们，胡忠雷师兄、牛维环师姐、吴玉乾师兄、谢小东师兄、解敏敏师姐、闫亚飞、张兴坦、祝慧敏、王峰、杜小莉、 王佩、杨玲、熊海军、罗会松、吴向伟、聂梦云、陈晓乐、罗培、张晓颖，感谢 你们给我的支持和各种帮助，很开心和你们有一起走过的日子。还要感谢兄弟实验室的龙瑞才师兄、石桂芹师姐、黄龙翔、赵茜、唐洲、张月娥、冯丹丹、熊方杰、张慧莹，感谢生物工程学院的钟冬火、齐肇然给我的建议和帮助。感谢重大科协的函锦姐，培养办刘京诚主任，国际学院龙庆会主任、王晓燕老师，伽利略意大利中心的 Claudio 老师和 Claudia 老师，Glazie！

      特别感谢家蚕基因组学国家重点实验室的老师和同学们，在西大学习生活期间，大家寄予了我无微不至的关怀和帮助；你们勇攀科学高峰的志向和精诚协作的团队精神，令我敬佩，对我产生了很大影响。非常感谢崔红娟老师、刘仕平老师、林英老师、何华伟老师、陈玉琳老师、查幸福老师，赵敏师姐、李志清师兄、郭鹏超师兄、张艳师姐、董照明师兄、马三垣师兄、王峰师兄、蒋亮师兄，孟勐、陈全梅、刘园园、王丹丹、郭慧珍、秦晓旋、秦道远、易小慧、曹妮、陈燕飞。 

     深深的感谢我们家老刘和小乔的养育、培养、支持与理解，谢谢你们，亲爱的爸爸、妈妈。感谢始终无条件信任、支持我的亲戚朋友。感谢我亲爱的姥姥，您在我研究生二年级时那么突然离开了——这是我们永远挥之不去的痛，感谢您那隽永的爱，“家有一老，如有一宝”，正是开明、勤劳、善良、智慧的您成就了我快乐幸福的童年、少年，可到我能理解这一切的时候已经太晚了，对不起。

全文完。

致谢来源：重庆大学博士学位论文

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