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该文章2021年发表于Cell Proliferation，题目为《Sorafenib attenuates liver fibrosis by triggering hepatic stellate cell ferroptosis via HIF-1α/SLC7A11 pathway》，影响因子8.755分，中科院二区。
关键要素疾病：肝纤维化
关键要素在【肝纤维化】疾病中，主变量【索拉非尼】通过效应变量1【HIF-1α】，调控效应变量2【SLC7A11】进而介导【铁死亡、肝星状细胞活化、纤维化】表型，从而抑制肝纤维化。
逻辑关系因果逻辑（1）：主变量【索拉非尼】介导【肝星状细胞活化、纤维化、铁死亡】表型
因果逻辑（2）：主变量【索拉非尼】调控效应变量1【HIF-1α】
因果逻辑（3）：主变量【索拉非尼】调控效应变量2【SLC7A11】
因果逻辑（4）：效应变量1【HIF-1α】调控效应变量2【SLC7A11】
数据解读 Figure 1. Ferroptosis occurs in mouse fibrotic liver induced by sorafenib.
【动物水平】主变量与表型【肝星状细胞活化、纤维化、铁死亡】的调控关系论证（单变量论证，正向操作）
图 1A：HE染色，马松染色，天狼猩红染色实验表明，索拉非尼处理可以显著减轻CCl4诱导的肝细胞变性、炎性细胞浸润、纤维性瘢痕和胶原沉积（正向操作，纤维化表型）。
图1B：索拉非尼降低了CCl4引起的肝脏/体重比值升高以及羟脯氨酸含量的升高（正向操作，纤维化表型）。
图 1C：索拉非尼显着降低血清ALT和AST的水平（正向操作，纤维化表型）。
图 1D：WB检测肝星状细胞活化和纤维化标志物α-SMA、COL1α1和纤连蛋白在CCl4处理组中高表达，而在索拉非尼处理组中显着降低（正向操作，肝星状细胞活化和纤维化表型）。
图 S1免疫组化染色显示，在CCl4诱导的纤维化瘢痕周围的HSC中观察到明显的GPX4和SLC7A11免疫染色信号，而索拉非尼处理降低了GPX4、SLC7A11和α-SMA的表达，但增加了PTGS2的表达（正向操作，铁死亡表型）。
结论：索拉非尼可减轻CCl4诱导肝星状细胞活化和肝纤维化，增加了铁死亡。
Figure 2. Sorafenib inhibits HSC activation by triggering ferroptosis in vitro.
【细胞水平】操作主变量观察【肝星状细胞活化、纤维化、铁死亡】表型的变化（单变量论证，正向操作）
图2A：通过CCK-8实验发现浓度为5-40μM的索拉非尼剂量依赖性地抑制HSC-T6细胞活力。LDH试剂盒检测AML-12细胞的细胞毒性发现，浓度低于20μM的索拉非尼处理肝细胞（小鼠，AML-12细胞系）不会产生毒性作用（正向操作，肝星状细胞活化表型）。
图 2B：CCK-8实验发现索拉非尼介导的HSC-T6细胞生长抑制完全被Fer-1和DFO中断。凋亡抑制剂ZVAD-FMK在一定程度上也阻碍了索拉非尼的抑制作用。然而，坏死性凋亡抑制剂necrosulfonamide对细胞活力没有影响。表明索拉非尼调节细胞活力是通过铁死亡过程,排除了凋亡和坏死性凋亡。（正向操作，表型嵌套）。
图 2C：通过透射电子显微镜观察对照组和索拉非尼处理组的线粒体。发现在索拉非尼处理的HSC-T6细胞中观察到线粒体凝结和破裂，表明索拉非尼可导致线粒体结构破坏,引发铁死亡（正向操作，铁死亡表型）。
图2D:在索拉非尼处理的HSC-T6细胞表现为GSH含量降低、铁水平升高和脂质过氧化产物增加（正向操作，铁死亡表型）。
图2E:WB实验表明，索拉非尼处理后，细胞中GPX4和SLC7A11的蛋白水平显著降低（正向操作，铁死亡表型）。
图2F:与对照组相比，索拉非尼下调了α-SMA、COL1α1和纤连蛋白的水平（正向操作，肝星状细胞活化和纤维化表型）。
总结：索拉非尼可减轻肝星状细胞活化、纤维化，促进铁死亡。
Figure 3：Sorafenib triggers HSC ferroptosis with no effect on hepatocytes or macrophages. AML-12, RAW 264.7 and HSC-T6 cells were treated with sorafenib (10 μM) for 24 h.
【细胞水平】操作主变量观察【肝星状细胞的铁死亡】表型的变化（单变量论证，正向操作）
图3A-E:在HSC-T6细胞中，索拉非尼使PTGS2 mRNA、铁、MDA和ROS水平升高，而GSH含量下降。然而，索拉非尼处理AML-12和RAW 264.7细胞，都没有表现出铁死亡，说明索拉菲尼特异性的促进肝星状细胞的铁死亡表型,而不是巨噬细胞和肝细胞.（正向操作，铁死亡表型）。
总结：索拉非尼特异性促进肝星状细胞铁死亡。
Figure 4. Blockade of HSC ferroptosis abolishes sorafenib-induced antifibrotic effect. HSC-T6 cells were exposed to Fer-1(1 μM), DFO (100 μM) or/and sorafenib (10 μM) for 24 h.
【细胞水平】主变量通过调节铁死亡表型影响肝星状细胞活化、肝纤维化表型（回复实验，表型嵌套）
图4A和D：索拉非尼诱导的细胞内铁、MDA、GSH 含量和细胞内ROS的升高随着加入Fer-1和DFO而减少（正向操作，铁死亡表型）。
图4B和E：索拉非尼处理的HSC-T6细胞中降低的GPX4蛋白水平可被Fer-1和DFO逆转，而SLC7A11蛋白被DFO部分升高，但不受Fer-1影响（反正正，铁死亡表型）。
图4C和F:在索拉非尼处理的HSC-T6细胞中观察到肝星状细胞活化指标表达减少，并且该保护过程受到Fer-1和DFO的抑制（反正正，肝星状细胞活化表型表型，表型嵌套）。
总结：抑制肝星状细胞的铁死亡可以导致索拉非尼诱导的抗肝星状细胞活化和抗纤维化作用。
Figure 5. HIF-1α expression is decreased during sorafenib-induced anti-fibrosis.
【细胞水平】主变量调节效应变量1的表达和定位，并且依赖于效应变量1调节肝星状细胞活化、肝纤维化表型（回复实验）。
图5A：与对照组的肝脏相比，纤维化肝脏中的HIF-1α蛋白水平显著升高，索拉非尼降低了HIF-1α蛋白水平（正向操作，调控论证）。
图5B：索拉非尼处理HSC-T6细胞时，荧光染色分析显示细胞质和细胞核中的HIF-1α均下降（正向操作，调控论证）。
图5C:WB证实索拉非尼处理降低了HIF-1α在细胞质和细胞核中的表达（正向操作，调控论证）。
图 5D：作为HIF-1α脯氨酰羟化酶抑制剂二甲基乙二烯丙基甘氨酸 (DMOG) 和 DFO，处理细胞后，细胞核中的 HIF-1α显着增加。在细胞质中，DFO处理的细胞中 HIF-1α水平增加，但不受 DMOG 影响(正向操作)。
图 5E：DMOG和DFO也抵消了索拉非尼的抗纤维化作用，α-SMA、COL1α1 和纤连蛋白的表达证明了这一点（反正正）。
总结：索拉非尼可降低HSC细胞核和细胞质中的HIF-1α。但是，HIF-1α蛋白的稳定性增加则阻碍了索拉非尼的抗肝星状细胞活化和抗纤维化作用。
Figure 6. Stabilization of HIF1α protein abolishes HSC ferroptosis and SLC7A11 reduction induced by sorafenib.
【细胞水平】主变量调节铁死亡表型依赖于效应变量1（回复实验）。
图6A：在HSC-T6细胞中，索拉非尼诱导铁死亡受到DFO和DMOG的阻碍（反正正）。
图6B：保护HIF-1α免于降解可以消除索拉非尼诱导的SLC7A11的消耗（反正正）。
总结：索拉非尼依赖于HIF-1α调节铁死亡表型。
Figure 7. Sorafenib triggers HSC ferroptosis via HIF-1α/SLC7A11dependent mechanism. Exposure HIF1α plasmid to HSC-T6 cells for 48 h, with or without sorafenib (10 μM) treatment for 24 h.
【细胞水平】效应变量1调节效应变量2和铁死亡表型；主变量调节铁死亡表型依赖于效应变量1（回复实验）。
图7A和B：转染HIF-1α质粒48小时后，HSC-T6细胞中HIF-1αmRNA和蛋白水平显著增加，证实转染效率（正向操作）。
图7C：SLC7A11和GPX4蛋白在HIF-1α过表达的HSC-T6细胞中显著上调（正向操作，铁死亡表型）。
图7D：索拉非尼诱导的铁死亡被HIF-1α过表达所抑制（反正正）。
总结，HIF-1α的过表达提高了SLC7A11蛋白水平，从而削弱了索拉非尼诱导的HSC铁死亡。（回复实验，与上文的稳定剂不同，这次选择质粒过表达）
图S2、7E和F:与用对照siRNA转染的细胞相比，HIF-1α siRNA-i在转染48小时后诱导HSC-T6细胞中HIF-1α mRNA和蛋白质水平的显著降低（反向操作）。
图7G:在进行或不进行索拉非尼处理的情况下，HIF-1α的siRNA显著降低了SLC7A11的荧光强度（反向操作，铁死亡表型）。
图7H-7I：在HIF-1α沉默的HSC-T6细胞中，GPX4和SLC7A11蛋白水平显著降低，铁死亡增加（反向操作，铁死亡表型）。
总结：HIF-1α沉默降低SLC7A11蛋白水平，并诱导铁死亡表型。
Figure 8. HIF-1α is involved in the anti-fibrotic effect of sorafenib.
【细胞水平】主变量依赖于效应变量1调节肝星状细胞活化的表型的回复论证（回复实验）。
图8A和B：在索拉非尼处理的HSC-T6细胞中，α-SMA和COL1α1的表达因HIF-1α的沉默而进一步降低，并因HIF-1α的过表达而部分回复（反正正）。
总结：索拉非尼依赖于HIF-1α调节肝星状细胞活化的表型。
论证规范 1. 单变量论证（表达差异，一正一反，细胞动物）
（1）筛猜主变量（无）
（2）索拉非尼表达差异（不涉及）
（3）索拉非尼临床相关性（不涉及）
（4）主变量索拉非尼调节铁死亡，肝星状细胞活化的细胞实验（正）（图2A-F,图3A-E）
（5）主变量索拉非尼调节铁死亡，肝星状细胞活化表型的动物实验（正）（图 1A-D,图S1）
（6）表型嵌套，主变量索拉非尼依赖于铁死亡表型调节肝星状细胞活化表型（图4A-F）
2. 调控关系论证（两两调控，三三回复）
（1）主变量索拉非尼与效应变量1【HIF-1α】的调控关系（图5A-C）
（2）主变量索拉非尼与效应变量2【SLC7A11】的调控关系（图S1）
（3）效应变量1与效应变量2【SLC7A11】的调控关系（一正：图7A-C，一反：图S2、7E-H）
（4）效应变量2调节表型（图7I）
（5）主变量索拉非尼依赖效应变量1【HIF-1α】调节表型2的回复验证（图5D-E;图8A-B）
（6）主变量索拉非尼依赖效应变量1【HIF-1α】调节表型1的回复验证（图6A-B，图7D）
本文优点：本文属于药物 分子 分子的三元变量间接机制的文章，包含因果关系的表型嵌套，论证优于多表型平行展开的表型嵌套模式。使用多株不同功能的细胞做对比，研究索拉非尼治疗肝星状细胞的特异性作用，为临床应用奠定扎实的实验基础。索拉非尼、HIF1-α均非首创，故不承担创新性，作者充分论证，如何利用老药新用，以间接机制发表在5分以上期刊，思路值得借鉴。
本文缺点：本文主变量索拉非尼、效应变量HIF1-α与表型的关系已知，主变量与效应变量1的调控关系已知，导致创新不足。而只有一株细胞的论证和缺乏直接机制的探索限制了论证的广度及深度。
END
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