admin 百科大全 2023-02-07 12:34:51

qPCR，你的结果 “阳” 了吗？ - MedChemExpress

首先，帮大家区分一下几个生物实验中飘来飘去的“象形”词——PCR、qPCR、逆转录/反转录……

PCR (Polymerase Chain Reaction)：聚合酶链式反应，基于碱基互补配对原则放大扩增特定 DNA 片段的分子生物学技术，即将微量的 DNA 指数增加。

qPCR (Quantitative Real-time PCR)：实时荧光定量 PCR，一般是 real-time PCR 的简称。指在 PCR 反应中，通过荧光化学物质检测 PCR 循环后的产物总量，反应中需通过内参或外参对特定 DNA 进行定量分析。后续可通过扩增曲线 (Amplification curve) 和熔解曲线分析 (Dissociation curve) 定量结果。

逆转录或反转录 (Reverse transcription)：是指以 RNA 为模板，在逆转录酶的作用下，合成 cDNA 的过程，通常所提及的 RT-PCR 或 RT-qPCR 词中的 RT 便是此意。后续便可以此 cDNA 为模板进行 PCR 或 qPCR 实验。

图 1. 分子生物学的中心法则

RNA-cDNA-qPCR，是做定量的一个常见实验流程，即先从目标样本中提取 RNA，通过逆转录酶进行逆转录得到单链 cDNA，并以此为模板进行 qPCR，大都为验证某个基因的相对表达量，那如何让这个过程 “丝丝滑滑” 呢？

RNA 的质量很关键

若想定量数据好，优质 RNA 可是个宝！RNA 提取时的注意事项就不再 balabala 了，得到 RNA 后，对其质量进行检测分析那可少不了。嚯嚯，下面这两方面可得好好 “宣讲” 一下。 ■ 浓度和纯度RNA 具有连续的吸光谱，其在 260 nm 处具有最高吸收峰；蛋白在 280 nm 处有最大吸收峰；230 nm 处的吸光度可反映乙醇、GTC、GuHCl、EDTA 等的含量。因此，在 RNA 的质检参数中，260、280 和 230 nm 下的吸光度分别代表了核酸、蛋白质及有机溶剂等的值。一般情况下，RNA 纯度检测时我们大都只看其在 OD260/OD280 比例中的数值范围，少量的蛋白、盐或基因组等污染我们是可以接受的。

(得嘞，RNA，娇贵娇贵！包容包容！我懂我懂！)

图 2. RNA 质量的判断

■ 完整度评估

mRNA 约占总 RNA 的 3%，rRNA 约占总 RNA 的 80% 以上。一般可通过凝胶电泳对 RNA (主要是 rRNA) 的完整性进行评估。那如何通过 RNA 的胶图分析这各种污染 “Bug” 呢？

以真核生物举例：完整的总 RNA 电泳后会产生 28S、18S、5.8S 的 rRNA 条带，28S 与 18S 的条带强度大致比例应为 2:1 (图 3a)。电泳条带 5.8S rRNA 出现则表示有轻微降解。RNA 本身就 “矫情”，得 “富养”~，因此在一般实验中，5.8S 条带出现很正常，但如果只有这一种条带且有明显弥散现象 (图 3b)，后续逆转录的话还是建议 “及时止损” 吧！

若在 28S 以上出现多余的条带，还贼亮，gDNA 污染，无疑了 (图 3b)！若在点样孔中还有明亮亮的 “钉子户”，大概率的蛋白污染，可以“定罪了”。

真核生物胶图的目的条带为 23S、16S 和 5S，质检方法参照以上即可。

(如果你跑的胶明显的干干净净、“不染世俗”，小可怜，RNA 提取，再来一遍吧！)

图 3. RNA 凝胶电泳图。a. 高质量 RNA；b. gDNA 残留；c. 蛋白残留；d. RNA 降解。

逆转录，这些坑能躲则躲

还是以真核生物举例：RNA 逆转录为 cDNA，看似简单，实则 “心潮澎湃”，屡战屡败的实验汪们已经小心到呼吸频率都降低了，但各种问题还是奇奇怪怪，而且跨完 “此坑” 又见 “彼坑”。

冷静冷静，你能行！戳一戳，往期逆转录避坑指南，你想要的答案都在这里 (→RNA 逆转录失败，达咩！)。

qPCR 十做九“谢”，这些操作你可长点心吧

qPCR 到底有多“诡异”，你且看看这些痛苦科研汪的 “表白桥段”：“实不相瞒，这 qPCR 的 S 曲线一点都不 S，它的腰去哪了？”——没了！“一杯敬实验，一杯敬文章，看完 qPCR 的结果，我不想谈恋爱了。”——单着！“看完我的 Ct 值，我就知道，不用 △△t 了，再爱已经没有意义了。”——分手！“师姐，qPCR 都做好多次了，扩增曲线还是乱七八糟，是不是我不配？”——不配！