admin 动物行为实验指南｜T迷宫用于评估空间工作记忆的行为学测试方法总结（1）
撰稿丨脑声常谈 瑾瑜（笔名）
排版丨
T迷宫任务可用于大鼠、小鼠、沙鼠、猪、绵羊、山羊、乌龟和鸽子等。对于大鼠和小鼠来说，有空间组织的测试通常学习得很快，并且执行得非常准确。相比其他品系，C57BL/6小鼠被广泛认为更适合进行行为任务，但大多数近交繁殖品系也表现良好，如白化小鼠NMRI、CD-1等。129S2Sv小鼠，或具有较多129遗传背景的转基因小鼠，最好避免使用。Hooded Lister大鼠是理想的实验动物，但白化品系的Sprague-Dawley或wistar大鼠也表现得相当好，但可能在迷宫中行动速度会慢一些。至于每组动物的数量，这可以是非常灵活的，因为该测试可以重复很多次，以增加数据量。
因此，如果你有10只对照组大鼠和10只损毁组大鼠，并且只是想知道两组是否有差异，每只大鼠进行5次试验通常就足够了。其实，T迷宫交替任务也可以用来量化单个啮齿动物的表现。例如，你可能希望检查在一组海马损毁的大鼠中，每只大鼠是否都有明确的功能损伤。为了评估单个动物的表现，可能需要20+个试验/大鼠。如果动物的适应程度良好，每次试验通常只需要1-2min。
实验设备是一个封闭T迷宫或一个相同尺寸的高架T迷宫。手动运行的T迷宫很容易构建，但也是相当劳动密集型的。不过，现在也开发出自动T迷宫，可以商业购买。T迷宫包括两个目标臂和一个与之垂直的起始臂或称主干臂。图1展示了一个T迷宫的平面图。表1展示了适合大鼠或小鼠的T迷宫尺寸。起始臂的宽度应适用于配有中心分区进行自发交替的迷宫。如果只将迷宫用于奖赏交替，则10厘米的宽度能使大鼠更快速地转向目标臂，从而获得更好的本体感觉反馈和任务表现。建议小鼠的起始臂宽度设计为7厘米。在封闭迷宫中，对于小鼠，墙壁应为20厘米高；对于大鼠，应为30+厘米高。目标臂之间应包括一个可拆卸的中央隔板，使动物在采样阶段一次只能进入一个目标臂。如果没有这个隔板，动物可以在第一个采样阶段对另一个臂进行部分采样，这可能会对选择阶段造成干扰。
T迷宫已经使用了一个多世纪，已经尝试了许多设计。例如，一些研究人员选择设计一个单独的起始盒或可关闭的目标盒使其与目标臂分开。虽然目前T迷宫的设计是简单通用的，但若试图复制其他研究人员的工作结果，建议一定要精确地复制他们的迷宫设计。迷宫可以由灰色或黑色的油漆木材、中密度纤维板（MDF）或聚氯乙烯（PVC）等塑料制成。把迷宫漆成灰色或黑色的原因是啮齿动物倾向于避开明亮的地方，比如白色的地板。一个白色的迷宫可能会引起焦虑，从而适应的速度也会更慢。黑鼠可以选择浅灰色迷宫，白鼠可以选择灰色或黑色迷宫。对于高架T迷宫，平面图与封闭T迷宫的尺寸相同。对于小鼠，一般将迷宫安装在离地面至少30厘米的架子上；对于大鼠，一般安装在离地面至少60厘米的架子上。强烈建议在高架T迷宫周围安装透明的有机玻璃或黑色矮墙，以减少动物的焦虑并且防止它们掉落。对于小鼠，矮墙高度可设置为1厘米高，大鼠可设置为3厘米高。
图1：T迷宫平面图。尺寸为厘米： R =大鼠，M=小鼠
表1：T迷宫尺寸（长度×宽度）汇总。所有的单位都是厘米
在开始T迷宫任务之前，应确定入臂标准。一般来说，每次试验选择的标准是整个动物（包括尾巴尖）均进入目标臂内。一些研究人员可能也会选择使用其他标准，比如四只脚进入目标臂，或者只使用两个前足进入作为标准，但建议包括尾尖，因为当所有四只脚都进入一个目标臂时，动物仍会犹豫并可能纠正自己的选择（其实也证明大鼠正在识别，即认知过程正在发生）。值得注意的是，当它们最终进入正确的目标臂时，它们会迅速移动到臂的远端。因此，这个包括尾尖的标准可能是最敏感的。但无论采用哪种标准，只要严格遵守，就应该不会存在实验者偏倚的问题。但为了完全避免实验者偏倚的可能性，采取实验者对动物分组的盲法是可取的。这很容易实现，例如，通过在药理学研究中将药物治疗进行编码，最好是由行为训练人员以外的人来管理。
如果执行奖赏交替任务，请遵循下面的选项A。如果进行自发交替任务，请遵循下面的选项B。
A．奖赏交替任务
1. 实验程序
(1) 抚摩：把你的手放进饲养笼里，慢慢地让动物适应你的触摸，先不要一开始就把它们拿起来。双手合拢成杯状托住一只动物，轻轻地握紧一点（或者通俗点说放在手里轻轻rua几下）。把它们托起来，过一会儿再把它们放回笼子里，不要抱太久；或者如果它们变得激动也要及时放回笼子里。最好地让动物适应抚摩的方法是抓住它们的身体而不是尾巴，并逐渐增加抚摩的时间。如有必要，间隔5 min重复几次。一定要有足够的间隔，把它们放回笼子里使它们再次变得平静。适应是很重要的一步，除非它们都很适应和放松，否则它们不会把任务学得很好。
(2) 在饲养笼里给动物喂实验时用的奖赏食物，使动物在熟悉的环境中适应奖赏食物的味道，以避免面对没吃过的新食物而产生的低食症，因为啮齿动物对于吃新东西很警惕。关于给它们的确切的数量在此阶段并不重要：对于大鼠，大约每只给予20颗奖赏食丸；对于小鼠，大约每只2毫升奖赏牛奶。在光暗循环的黑暗阶段开始前一小时，将食物盛在一个小盒子里，放进饲养笼。（注意找一个合适的容器以免垫料大量混进食物里）。
(3) 食物限制。食物限制对于增加和维持大/小鼠执行T迷宫任务的动机至关重要。称重每只动物并记录，在饲养笼内定量配给啮齿动物专用食料。关于喂食量，对于小鼠，大约1.5克/只；对于大鼠，约5克/100克体重。把食物掰成小块，这样可以尽量避免某些动物垄断食物。使每只动物保持在其自由喂养体重的85%以上，90-95%是最理想的。如果实验时间持续一周以上，并且动物还没有完全长大，一定要确保它们的体重按照正常的生长曲线有规律地增加；不能将体重保持在初始自由喂养体重的固定百分比。在测试和训练期间，每天给实验动物称重，以监测健康状况和食物限制程度，允许大鼠在限制饮食下每周增长5克体重。考虑到动物福利伦理，我们建议限制饮食时不应导致体重下降到自由喂养体重的85%以下。如果体重在自由进食体重的85%时还没有动力进行任务，这可能意味着适应地还不够。动物适应得越好，就越不需要定量配给来促使动物顺利进行迷宫任务。训练有素的动物即使吃了很多正常饲养食料，在迷宫中也会行动以寻求奖赏食物。单笼饲养虽然可以更好地控制每一只动物的体重，但是这种社交隔离也会增加动物的应激和焦虑。
(4) 试验前准备：在任何行为任务中，动物应该处于测试的最佳唤醒状态。把它们带进测试室后，让它们待一个小时。如果立即进行测试，它们就会过度兴奋，不集中注意力。相反，也不要让它们待一个小时以上，否则它们可能会睡觉。
(5) 适应和训练试验
首先适应动物，如下文（i）（ii）（iii）所述。当动物被单独放在迷宫中时，能够毫不犹豫地探索，并且没有过度排便或排尿，代表动物适应良好, 这通常是在训练后的4天内达到。可以先用迷宫样的设备适应，逐步再用真正的T迷宫适应，尤其是当动物看起来很紧张时最适合这样逐步适应。一旦这些动物适应了，通常每天进行10次试验。下文步骤（iv）采样试验和步骤（v）测试试验为一对匹配训练。一次匹配测试后将动物放回饲养笼。即第一只动物测试完，随后这一组的动物依次进行它们各自的第一个匹配测试，然后进行下一轮。每个试验的采样目标臂由随机序列确定，每个动物和每个测试阶段都有不同的序列。连续相同臂的最大数量为三个，以防止养成位置定式的习惯。合适的随机序列可以由计算机生成。
（i）让动物适应迷宫样的环境。(A) 对于封闭迷宫的预适应，可以用一个巷道装置，类似迷宫的一个臂。让动物从装置的一端跑到另一端，在那里放有充足的奖赏食物，并允许它们喝或吃掉所有食物。如果事先进行了很好的抚摩适应，每组使用3分钟的适应试验，然后进行下一组。大多数动物在六次试验之内就能实现在装置中大胆跑动。(B) 对于高架迷宫的预适应，由于迷宫的高度和缺乏高墙所引起的更大的焦虑，将需要更多的适应。特别是对于小鼠，它们在升高的环境/迷宫中更不容易进食。因此，在高处训练之前，在封闭环境中的过渡训练可能是必要的。这样它们就不会像是直接从饲养笼到高架十字迷宫的开臂一样跨度那么大。接着，非常建议让它们先在一个有食物的中等高度的平台上适应。对于小鼠，一个大约30 ×10厘米的矩形平台，可以用于群体适应，把同一笼的都放上去。对于大鼠来说，一个50厘米的正方形会是一个合适的平台大小。当所有的大鼠/小鼠都能在平台上吃东西时，就可以在此平台上单独适应它们，然后再去适应T迷宫本身。
（ii）在进行奖赏交替测试之前，动物必须适应T迷宫。最好的方法是将所有闸门都打开，沿着迷宫放一些奖赏食物，并把整个饲养笼里的一组一起放进迷宫适应大约3 min。在迷宫中让同一笼的动物一起探索，会让它们在探索的初始阶段更舒适，并减少每只大/小鼠适应迷宫所需的时间。如有必要，可以及时补充奖赏食物。这样大约四次（如果它们吃食物的速度很慢可以进行更多次），适应间隔时间至少为10 min。T迷宫适应期应该只需要1天或2天。可以再持续适应两天，一天只把食物放在迷宫的臂上，然后第二天只放在臂的末端。
（iii）最后适应是将其中一个目标臂的闸门关闭，让单个动物从起始臂开始行动，在左右两个臂进行相等数量的适应。
（iv）在采样和测试试验中均使用奖赏食物进行强化。采样试验中，关闭一侧目标臂，将动物放在起始箱域，强迫动物进入另一侧目标臂，吃掉所有的奖赏食物。实验者如果需要在现场，那就站在起始箱的中央，这样实验者的身体位置就不会影响动物的臂选择。
（v）当动物吃完所有的奖赏后，把它放回起始臂的末端，将其限制在起始位置一段设定的时间（从0 s到几分钟都可，5 s是理想的时间），每次和每只动物都使用相同的时间。较长的等待时间会增加任务难度，也就是说，增加了动物必须记住它最后进入了哪只臂的时间长度。之后开始测试试验。这次将两个目标臂的闸门都打开，并只在采样实验中被阻挡的那个臂上放置奖赏，小鼠的标准奖赏一般是用1毫升注射器或固定吸管提供的0.07毫升的1：1（vol/vol）水/全脂甜炼乳，大鼠的标准奖赏是两个45毫克的奖赏颗粒。在起始箱让动物背对目标臂（如果起始箱通过加装闸门设置了起始箱，则将动物放入起始箱即可，然后再打开闸门），然后允许它自由选择一个臂。如果选择正确，给予充足时间让它们吃完所有食物。如果选择不正确，只需关闭目标臂的闸门来限制动物一定时间后再将其移出，以确保动物能发现该臂是没有奖赏的。限制的时间相当于正确反应中的进食时间。因此，这是一个非修正程序。
（vi）当动物表现稳定且选择准确性高时（训练达标标准是工作记忆错误小于15%）开始进行给药测试或脑区损毁研究。或者，也可以研究药物或脑区损毁对学习这项任务的影响，那给药和损毁需要在训练前进行。
图2：奖赏交替任务
2. 评价指标与数据分析
记录进入食物强化臂的次数（正确选择）和再次进入非强化臂的次数。反复进入一个无奖赏的臂被认为是一种工作记忆错误。将数据表示为：(1).柱状图，显示为在给定的测试期间对照组、脑损毁组或药物测试组的平均正确选择百分比 (单因素：分组)，或 (2).直线图，比较每组及每天测试阶段的正确选择百分比（双因素：分组和测试日）。对于包含少量试验的实验，可以计算每只动物的正确百分比，并使用成对对照组与处理组的t检验比较或多组比较的ANOVA分析结果数据。对于较长时间的实验，将数据分割成合适的试验块，并执行重复测量方差分析。此外还可以记录选择潜伏期，潜伏期反映动物的运动能力和对任务执行的积极性。
3. 时间
每次试验的时间应不超过2 min。正常健康的大鼠将在7到10天内准备好进行任务训练（包括足够的食物限制和充分适应T迷宫），而且在训练时几乎每次都能完美地完成这项任务。一只健康有动力的大鼠应该在5天内达到任务标准。
4. 注意事项
(1). 在训练过程中，即在给与任何处理因素之前，如果一只动物在90 s内没有沿迷宫移动，请将其移除，然后过一会儿再试一次。经验表明，这是对付那些不动的动物的最好方法。如果将它们继续留在迷宫中，希望最终它能动起来，可能会浪费很多时间，而且动物往往变得更加焦虑，这种焦虑将会与迷宫联系在一起，可能会造成恶性循环，动物更不愿意动了。最好的办法是取出动物，重新让它在不同环境下适应奖赏食物，首先在饲养笼里，然后在不同的新环境中，最后再在迷宫中适应。然而，如果动物在已经给与处理因素后（比如给药或脑区损毁）发现不动，那90秒的时间限制是中止试验的合理标准。然后，可以将这种失败的试验次数与对照组的失败试验次数进行比较，并得出关于处理因素对动机的影响的结论。
(2). 每次试验通常只需要一分钟多一点的时间。如果动物没有迅速吃完奖赏，就代表它们没有进行足够的适应/训练，动机不足，将很难阐明结果反映认知方面而不是动机/训练方面的程度。
B．自发交替任务
自发交替任务是基于这样的现象，即啮齿动物以交替的方式探索它们的环境，即使探索没有得到食物的奖赏，啮齿动物仍对环境有探索动机。该任务的正常交替表现需要完整的工作记忆能力。药理学操作或脑区损毁通常是在测试自发交替任务之前进行的。该任务与奖赏交替类似，除了没有对迷宫进行适应，而是利用迷宫的新奇性驱动动物的自发探索/交替。该方案全程允许大/小鼠自由选择目标臂，在第一个采样试验中不像在奖赏交替那样需要设置强迫选择。因为这些动物的动机只是它们探索迷宫的欲望（也就是说，它们没有限制饮食），所以，动物必须对实验者和实验环境完全适应，没有恐惧感。
1.实验程序
(1). 选择一个安静而昏暗的房间，作为行为测试的实验室。
(2). T迷宫的位置以及迷宫外的视觉线索在整个测试过程中不变。
(3). 同上述奖赏交替任务一样的方式用手抚摩动物，使其对实验者完全适应。
(4). 在采样试验（T0）中，将经过充分抚摩适应的动物轻轻放在起始臂的远端，目标臂闸门都打开，让它离开起始臂自由选择一个目标臂。当动物进入一个目标臂时（尾尖标准），关闭该臂的闸门，将动物限制在选择的目标臂上30秒，记录选择的臂以及选择的潜伏期。
(5). 在30 s结束时，轻轻地取出动物（可以使用钻管的方式转移动物），并将其放回起始臂的远端。将其限制在起始箱一定时间（ITI），0 s到几分钟不等，5 s是较合适的时间。
(6). 对于测试试验，将步骤4和步骤5重复n次，试验数可以自己设置，通常进行5到12次试验。
(7). 实验结束后将动物放回饲养笼，运至动物房，收拾实验室卫生。
2. 评价指标
每次测试的实验结果表示为交替数除以所做出的选择总数, 即在整个测试实验中的交替百分比作为工作记忆的指标。将数据表示为：(1).柱状图，显示为在给定的测试期间对照组、脑损毁组或药物测试组的平均交替百分比 (单因素：分组)，或 (2).直线图，比较每组及每天测试阶段的交替百分比（双因素：分组和测试日），不过一般不会连续几天测试。此外还可以记录选择潜伏期，潜伏期反映动物的运动能力和对任务执行的积极性。
3. 时间
每次试验不超过两分钟；基本上一分钟是最短的时间。而且整体实验周期短，仅一天即可完成全部实验。
4．预期结果
如果这些实验程序正确运行，使用了合适的大鼠或小鼠品种，那么健康的野生型对照组通常达到至少80%的正确交替率，通常会更高。交替百分比越高，说明动物空间工作记忆能力越强。相反，当药物测试或脑区损毁等方法影响记忆时，交替百分比下降，在多次试验中，海马完全损毁的动物正确交替率超过60%的情况是很罕见的。任务对ITI长度很敏感，自发交替率与ITI成反比。
5. 注意事项
(1). 应该连续测试完一只动物的10次试验，再进行下一只的测试。不同动物之间可以清洁迷宫中的排泄物。一只测完加清理完大约需要25 min，如果处理因素是给药，应该在不同时间逐只给药，不能实验前统一给药。
(2). 应该设置完成一个试验的上限时间。对于测试试验，最大时间限制应为180 s，因为延迟时间超过3分钟，工作记忆就会变得太弱。为了控制焦虑相关或动机因素，采样试验也应设定时间限制。健康小鼠通常在小于15-20 s的时间内完成采样选择，采样试验的最大时间应设置为60 s。如果在任何试验中，动物超过了时间限制，轻轻地将其从迷宫中移出，并将其放回饲养笼，这次试验视为无效，至少30分钟后再重新测试（从T0开始）。
0条评论