2023新春特辑 | 靶向蛋白降解技术

Outline

1. 1.    基于小分子的靶向蛋白降解技术

2. 2.    基于大分子的靶向蛋白降解技术

3. 3.    新型蛋白标签用于靶向蛋白降解策略

4. 4.    拓展

1. 基于小分子的靶向蛋白降解技术

蛋白降解靶向嵌合体（Proteolysis targeting chimeras，PROTAC）是一种有吸引力的靶向蛋白降解技术，它是具有E3泛素连接酶结合部分与感兴趣蛋白(POI)结合部分连接的双功能小分子，通过招募泛素连接酶对目的蛋白进行泛素化实现靶向降解。PROTAC分子具有高效、低耐药性等特点，同时能靶向“无药可及”蛋白，其应用前景十分广泛。

• 开发E3连接酶配体

为了增加PROTAC在设计上的选择性，研究者们针对降解过程中形成的核心结构— “靶蛋白-PROTAC-E3泛素连接酶”进行了一系列的设计与优化。近期，有多项研究针对现有的E3连接酶开发了特异性的配体分子，其中研究者利用竞争性ABPP策略鉴定到E3连接酶DCAF1的C1113位点可以被他们所设计的探针MY1B特异性结合，在MY1B的基础上连接靶蛋白的小分子配体从而将其改造为PROTAC分子，并起到了靶向降解的作用【J. Am. Chem. Soc. | 通过亲电的位点选择性和立体选择的PROTAC试剂靶向蛋白降解】。另外，也有研究人员通过高通量筛选的方法从共价配体库中获得E3泛素连接酶FEM1B的特异性共价反应配体，与需要降解的靶蛋白配体连接从而进而降解靶蛋白【J. Am. Chem. Soc. | 开发招募E3连接酶FEM1B靶向降解的PROTAC分子】。

• 开发靶蛋白配体

除了开发E3泛素连接酶的特异性配体，靶蛋白配体的开发也充满挑战性，尤其针对没有小分子结合、无药可及的靶蛋白，PROTACs技术具有一定的局限性。于是研究者提出了一种新的PROTAC方法，称为桥接PROTAC，它利用目标蛋白的相互作用蛋白的小分子配体将蛋白质复合体招募到与E3泛素连接酶附近，以靶向无小分子配体可及的蛋白质靶标。以Cyclin D1靶蛋白为例，Cyclin D1与下游蛋白CDK4/6形成复合体，考虑到没有报道Cyclin D1小分子配体，因此研究者利用CDK4/6小分子高效、选择性的抑制剂设计并合成了一系列可能的桥接PROTAC分子，经过优化筛选发现MS28能有效降解Cyclin D1【J. Am. Chem. Soc. | 桥接PROTAC技术靶向降解无小分子配体可及的蛋白靶点】。

• 评价PROTAC分子的活性

为了评价PROTAC分子对靶蛋白的降解能力，研究者基于时间分辨的FRET策略，发展出能快速且高通量地检测靶蛋白和结合配体结合性能以及定量检测内源性蛋白含量的方法。在靶蛋白的抗体上连接FRET供体，靶蛋白抑制剂分子连接FRET供体，当抗体和抑制剂小分子都与蛋白结合时，促使FRET信号产生。针对结合配体的鉴定，在含有抗体和抑制剂分子的显色体系里，逐渐滴加细胞裂解液，观测FRET信号变化，再添加靶蛋白结合配体竞争处理，FRET信号减弱；针对蛋白含量的测定，在测定FRET信号前，如果PROTAC分子将蛋白降解，其FRET信号便可以直接反映内源性靶蛋白含量。【Cell Chem. Biol. | 直接的高通量蛋白定量策略用于发现BRD4降解剂】。

• 针对重要靶点开发PROTAC降解剂

近期的研究针对细胞中多种重要靶点开发了基于小分子的靶向降解剂。GPX4可以通过减少脂质过氧化来保护细胞免于铁死亡，因此通过PROTAC诱导GPX4的降解有可能会增加脂质过氧化并导致铁死亡，来实现更高效的铁死亡诱导效果。研究人员首先合成了乙二醇链接的带有GPX4抑制剂ML162和Pomalidomide基团的PROTAC小分子dGPX4，结构中的ML162部分能够靶向GPX4，氯乙酰胺部分可以和GPX4中的硒代半胱氨酸共价结合，Pomalidomide部分招募E3链接酶实现降解，并通过系列实验证明dGPX4诱导癌细胞铁死亡的策略具有通用性。【Angew. Chem. Int. Ed.｜设计GPX4的PROTAC降解剂以诱导癌细胞铁死亡】。

富亮氨酸重复激酶2 (LRRK2)是治疗帕金森疾病的重要靶点，该靶点的小分子抑制剂具有不同程度的脱靶效应和毒副作用，因此PROTAC技术可作为新的替代靶向策略，研究人员通过构建第一代和第二代化合物库成功筛选出了具有高降解活性的PROTAC分子【J. Am. Chem. Soc.｜靶向LRRK2的PROTAC分子XL01126的发现】。

2. 基于大分子的靶向蛋白降解技术

在过去的二十年中，基于小分子的蛋白质降解技术取得了重要进展，但它们仍有吸收差、生物利用度低等缺点。而基于大分子的降解技术，如LYTAC 技术展示了基于大分子进行蛋白靶向降解的潜力。最近有研究开发了一种利用抗体同时结合细胞膜E3连接酶和跨膜蛋白，从而诱导靶蛋白降解的蛋白水解靶向抗体（PROTAB）技术。研究人员设计的PROTAB是一种双抗，结构一端靶向靶蛋白IGF1R，另一端靶向细胞膜E3连接酶（RNF43或ZNRF3的N端糖蛋白D）。将PROTAB加入表达RNF43或ZNRF3细胞中，细胞表面的IGF1R可以被有效降解【Nature | 利用抗体使E3泛素连接酶靶向降解受体】。

异曲同工地，KineTAC技术是基于完全重组的双抗来诱导细胞表面和细胞外靶蛋白经溶酶体降解。研究人员发现趋化因子CXCL12与诱饵受体CXCR7结合后会进一步产生嵌合体内吞。基于这一原理将趋化因子CXCL12的N端融合到双特异性抗体一端的Fc结构域中，而另一端则融合感兴趣的蛋白抗体，并通过Knob-Hole的蛋白设计策略在单个哺乳动物结构中表达双臂，并完成双特异性抗体KineTAC的组装。KineTAC利用细胞因子的内化将细胞外及细胞膜上的靶蛋白靶向溶酶体进行降解，研究人员在PD-L1/HER2/EGRR等常见的膜蛋白上测试了KineTAC降解活性【Nat. Biotechnol. | 模块化细胞因子受体用于细胞表面和细胞外蛋白的靶向降解】。

最近也有研究利用酵母展示技术筛选纳米抗体来获得靶蛋白BCL11A选择性配体，将纳米抗体融合到一个细胞渗透性的微型蛋白和E3适配器上，从而产生一种高效的降解剂，这项研究开发出的蛋白类PROTAC分子为“无配体可及”蛋白质的靶向降解建立了一个新的范式。【ACS Cent. Sci. | 基于细胞渗透性纳米抗体的蛋白诱导降解剂】。

3. 新型蛋白标签用于靶向蛋白降解策略

靶向蛋白标签的蛋白降解策略(tTPD)通过设计能够结合E3泛素连接酶以及特定的蛋白标签的双功能分子，进而实现对细胞内带有特定标签的蛋白的选择性降解。近期已有多项研究开发了新的蛋白标签用于tTPD策略中。研究人员选取了商业可得的NanoLuc标签标记感兴趣蛋白，并将一种已知的NanoLuc抑制剂与CRBN的招募基团沙利度胺通过linker连接，并通过优化linker长度，最终找到了效果最优的降解剂，从而开发了靶向NanoLuc标签的蛋白靶向降解策略【Nat. Commun. | 靶向荧光素酶标签的蛋白降解子开发】。

在细菌等原核生物中，基于泛素标签降解系统的PROTAC技术没有办法使用，但是细菌内也有一套类似的“标签蛋白质降解”系统，只不过蛋白酶识别的不是泛素标签，而是磷酸化的精氨酸。ClpC:ClpP (ClpCP) 蛋白酶复合物对于微生物蛋白的降解是必须的，ClpC 部分是一个 ATP 酶驱动的去折叠酶，能够识别结合磷酸化的精氨酸；ClpP 则扮演了蛋白酶的降解角色。因为本研究首先设计了 BacPROTAC-1，包含三部分：与 ClpC 结合的 pArg，一段长 linker 和能够与靶蛋白结合的小分子，通过设计的双功能小分子，使细菌的降解系统识别并降解磷酸化精氨酸标签的蛋白。通过新型的蛋白标签“劫持”细菌或者支原体的 ClpCP 蛋白酶降解系统，开发出了能够在细菌内发挥功能的 BacPROTACs，这对于后续研究人员开发新的抗生素提供了新的思路。【Cell｜BacPROTACs 介导细菌内靶蛋白降解】。

4. 拓展

• 利用去泛素化酶的双功能小分子稳定蛋白质

PROTACs将目的蛋白招募到E3连接酶附近给蛋白加上泛素化标签从而实现蛋白质的蛋白酶体降解。这种异源双功能小分子还被广泛应用于靶向蛋白的内体、溶酶体水解以及磷酸化和去磷酸化，但是目前为止，还没有一种广谱性的小分子可以用于提高靶蛋白的稳定性。受PROTAC的启发，该研究开发了一种去泛素化酶靶向嵌合体（deubiquitinase-targeting chimeras，DUBTACs）用于靶向蛋白质稳定（targeted protein stabilization，TPS）。作者使用ABPP技术发现去泛素化酶OTUB1的C23位点具有较高的亲核性且不参与酶活性的调控，是一个比较理想的配体结合位点。随后作者利用小分子库与化学探针竞争的ABPP技术找到了一个与OTUB1有较高亲和力的共价配体EN523。将EN523与靶蛋白配体相连获得异源双功能小分子，可以有效稳定靶蛋白【Nat. Chem. Biol. | 利用去泛素化酶靶向稳定蛋白质】。

• 自噬溶酶体靶向降解蛋白质

现已开发利用蛋白酶体或溶酶体进行降解的工具，但对蛋白种类有局限性。有研究发现自噬运载配体p62结合ATL（自噬靶标配体），通过构象变化将无活性的p62激活为自噬相容形式。与ATL结合后，p62暴露其PB1结构域，与TBL（靶标结合配体）结合，发生自聚合并暴露其LIR结构域，与自噬膜上的LC3相互作用发生降解。在此基础上，研究人员构建了AUTOTAC平台：首先，AUTOTAC通过TBL和ATL将靶标结合到p62，形成三元复合物。其次，无活性的p62在结构上被激活，自寡聚化形成靶标-p62寡聚复合物，这是AUTOTAC的核心机制。接着，AUTOTAC通过巨自噬促进靶标-p62复合物的降解，该降解不依赖泛素和蛋白酶体。最后，AUTOTAC从溶酶体循环到胞质溶胶中的其他靶标，持续进行降解【Nat. Commun. | 通过自噬溶酶体靶向降解蛋白质的AUTOTAC平台】。

1. 以上为王初课题组2022年分享的文献中有关蛋白靶向降解的主要内容，欢迎大家交流与学习。

本文作者：ZJ