摘 要：目的：分析比较铁皮石斛及常见伪品中多糖和甘露糖的含量。方法：采用高效液相色谱法测定石斛中甘露糖的含量，紫外-可见分光光度法测定多糖含量。结果：分析表明，各个不同的石斛药材多糖和甘露糖含量存在较大的差异。多糖含量最高的是齿瓣石斛，含量为44.43%；其次是报春石斛，含量为41.08%；含量最低的为细茎石斛，含量20.23%。甘露糖含量中，钩状石斛居首位，含量为34.17%；其次是齿瓣石斛，含量为32.96%；含量最低的为细茎石斛，含量为17.60%。 结论：不同来源的铁皮石斛多糖和甘露糖含量均能达到2010年版《中国药典》要求，因此，传统以多糖和甘露糖为指标评价石斛质量是否合理有待进一步深入研究。中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2012)01-0146-03Determination of Sugar Content of Dendrobium Candidum and Several Common Counterfeit Drugs in the MarketZHENG Shanjiao1,LU Guiyuan2,CHEN Suhong1,YAN Meiqiu2,ZHOU Guifen2(1.Wenzhou Medical College, Wenzhou 325035,Zhejiang,China;2.Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053,Zhejiang,China)Abstract:Objective:To compare the content of polysaccharide and mannose in different kinds of dendrobium candium.Methods:Mannose in different types of dendrobium candium can be determined by HPLC and polysaccharide carried out by UV.Results:The analysis showed that the contents of polysaccharide and mannose in different kinds of dendrobium candium have obvious difference. The highest content of polysaccharide is the D. devonianum Paxt, which contains 44.43%; then the second one is the D. primulinum Lindl which contains 41.08%; the lowest is D.moniliforme, which only contains 22.30%. However, mannose content of D. aduncum Lindl. is highest, which contents 34.17%, the second is 32.96% in D. devonianum Paxt, the lowest for D.moniliformes is 17.60%.Conclusion:The content of polysaccharide and mannose in D.officinale Kimura et Migo from different sources can reach the 2010 edition of Chinese Pharmacopoeia requirement.Therefore, the conventional indicators of Polysaccharides and Mannose to evaluate the quality of Dendrobium is not reasonable. Further research should be developed.Key words:D.officinale Kimura et Migo;Polysaccharide;Mannose;HPLC石斛为兰科(Orchidaceae)石斛属 (Dendrobium Sw. )多年生草本植物，以新鲜或干燥茎入药。全球约有1500余种，广泛分布于亚洲、欧洲及大洋洲等热带及亚热带地区。我国有76种，主产于云南、贵州、浙江、四川、广西、安徽等，其中有30多种作为药用[1]。《中华人民共和国药典》2010年版收载的品种有金钗石斛 Dendrobium nobile Lindl、鼓槌石斛Dendrobium chrysotoxum Lindl.和流苏石斛Dendrobium fimbriatum Hook．var．oculatum Hook及其同属植物近似种的栽培品的新鲜或干燥茎，而铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)在一千多年前的道家经典《道藏》中将其列为“中华九大仙草之首”，2005版及以前版《中华人民共和国药典》将其归为石斛一类,而被2010年版《中华人民共和国药典》收载且单独列为一类的名贵中草药之一，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳[2]、调节免疫力［3］和抗肝损伤［4-5］的功效。目前，随着铁皮石斛药用价值的不断提高，使得人们对之过度采挖，导致野生资源濒临枯竭。由于石斛药材在化学成分和组织结构上具有一定的相似性，使种的鉴定和质量评价工作较困难，民间药用石斛品种较复杂且规格不统一，市场上出现了药材以次充好，以假乱真的现象。传统认为“口嚼无渣、黏性强”者为佳，文献及目前众多铁皮石斛相关产品生产厂家均以多糖含量作为质控指标，对石斛及其产品的质量进行评价[6-7]。2010年版《中华人民共和国药典》规定：铁皮石斛按干燥品计算，含铁皮石斛多糖以无水葡萄糖（C6H12O6）计，不得少于25.0%，含甘露糖应为13.0％～38.0％，甘露糖峰面积与葡萄糖峰面积的比值应为2.4～8.0。本文对不同来源的铁皮石斛及市场上常见的铁皮石斛伪品中多糖及甘露糖的含量进行测定和比较，以考察各种不同来源铁皮石斛与石斛不同品种间的差别，为更好地研究和开发利用这一贵重药材提供参考依据。1 仪器与试药Agilent 1200高效液相仪（DAD检测器，美国Agilent公司），LAMBDA-45 紫外可见分光光度计（美国Lambda公司），AR-2130 型电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司），LXI-ⅡB低速大容量多管离心机（上海安亭科学仪器厂）。乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其他试剂为分析纯。甘露糖对照品：中国药品生物检定所（批号：140651-200602）；葡萄糖对照品：中国药品生物检定所（批号：08339501）。石斛药材（见表1）来自不同产地，经浙江中医药大学资源与鉴定教研室陈孔荣副教授鉴定。2 方 法[8]2.1 甘露糖的测定2.1.1 色谱条件和方法色谱柱：Ultimate XB-C18（4.6mm×250mm，5μm），流动相为乙腈－0.02mol·L-1乙酸铵溶液（18∶82），流速1.0mL·min-1，柱温30℃，检测波长：250nm，进样体积10μL。在此色谱条件下，甘露糖与样品中的其他色谱峰达到基线分离。按照甘露糖峰计算，理论板数应不低于4000。对照品和样品色谱图见图1。2.1.2 内标溶液和对照品的制备取盐酸氨基葡萄糖适量，精密称定，加水制成每1mL含12mg的溶液，备用。取甘露糖对照品约10mg，精密称定，置100mL容量瓶中，精密加入内标溶液1mL，加水适量使溶解，用水定容至刻度，摇匀，即配成0.1 mg·mL-1对照品溶液。2.1.3 样品溶液的制备新鲜石斛药材（见表1），60℃烘箱烘干、粉碎。取石斛粉末（过3号筛）约0.12g，精密称定，加80％乙醇80mL置索氏提取器中提取4h，弃去乙醇液，药渣挥干乙醇，滤纸筒拆开后置于圆底烧瓶中，加水100mL，精密加入内标溶液2mL，称重，回流1h，放冷，加水补至约100mL，混匀，滤过，取续滤液1mL置于安瓿瓶中，加入3.0mol·L-1的盐酸溶液0.5mL，封口，混匀，110℃水解1h。冷却后，开封，用3.0mol·L-1的氢氧化钠溶液调节pH值至中性，即得供试品溶液。2.1.4 样品的测定取对照品溶液与供试品溶液各400μL，分别加0.5mol·L-1的PMP（1－苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮）甲醇溶液与0.3mol·L-1的氢氧化钠溶液各400μL，混匀，70℃水浴反应100min。再加0.3 mol·L-1的盐酸溶液500μL，用三氯甲烷洗涤3次，每次2 mL，弃去三氯甲烷液，水层离心10min后，吸取上清液，注入液相色谱仪，记录各色谱峰，结果见表2。.2.2 石斛多糖的测定2.2.1 葡萄糖对照品溶液的配制取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成每1mL含90μg的对照品溶液，备用。2.2.2 多糖的提取和制备新鲜石斛药材（见表1）60℃烘箱烘干、粉碎。取石斛粉末（过3号筛）约0.12g，精密称定，加水80mL，加热回流2h，提取液转移至100mL容量瓶中，用适量水多次洗涤容器，洗涤液转移至同一容量瓶中，冷却，加水稀释至刻度，摇匀，滤过。精密吸取续滤液2mL，置15mL离心管中，精密加入无水乙醇10mL，摇匀，冷藏1h，取出，离心30min，弃去上清液，沉淀物加80%乙醇洗涤2次，每次8mL，离心，弃去上清液，沉淀物加热水溶解并转移至25mL量瓶中，冷却，加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。2.2.3 标准曲线的绘制精密量取葡萄糖对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置10mL具塞试管中，加水至1.0mL。精密加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，再精密加入浓硫酸5mL，摇匀，置沸水浴中加热20min，取出，放入冰浴中冷却5min，以相应的试剂为空白，在488nm的波长处测定吸光度，以吸光度（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程，即A=0.633C+0.0027（R2=0.9957），结果表明，葡萄糖浓度在2.571～12.857μg·L-1内与吸光度（A）线性关系良好。2.2.4 样品测定精密量取供试品溶液1mL，置10mL具塞试管中，照标准曲线绘制项下的方法，自“精密加入5%苯酚溶液1mL”起，依次测定吸光度，代入回归方程计算葡萄糖的质量浓度，再按下式计算多糖的量：多糖的量(%)=CD/W×100%。式中C为供试液中葡萄糖的质量浓度(mg/mL)，D为供试液的稀释倍数，W为供试品量,结果见表2。3 结果与分析3.1 石斛多糖含量比较石斛多糖与甘露糖含量结果见表2。从表中可以看出，含糖量最高的为S2，含量为44.43%；其次是S1，含量为41.08%；含量最低的为S4，只有20.23%。各个不同产地的石斛含糖量差别甚大，究其原因可能与其种植环境、生长年限、生长状况及植物本身的遗传特性有关，这有待于进一步深入研究。本实验收集的石斛，其伪品平均多糖含量为36.59%，而铁皮石斛的平均多糖含量为33.02%，两者相差3.57%，铁皮石斛含糖量最高值与伪品相差9.82%。铁皮石斛由于来源不同其多糖含量相差甚大，伪品和铁皮石斛间多糖含量无一定的规律性。因此，传统认为“质重、嚼之粘牙、味甘、无渣者为优品”[9]衍生的以多糖含量作为石斛质量评价指标存在一定的误区。3.2 石斛甘露糖含量和峰面积比值比较表中可以清晰地看出，甘露糖含量中S3居首位，含量为34.17%；其次是S2，含量为32.96%；含量最低的为S4，含量为17.60%。本实验中伪品的甘露糖平均值含量为29%，铁皮石斛的平均含量为27.26%，两者的平均含量相差1.74%，铁皮石斛甘露糖最高值与伪品最高值相差2.27%，两者相差甚大。由表显示，甘露糖在各个石斛属药材中所占的比例是不等的，从而其与葡萄糖的峰面积之比也不同，但在多糖和甘露糖含量相当的石斛中，如S1和S2，其甘露糖和葡萄糖峰面积比值相差很大，说明石斛水溶性多糖是由各种不同的单糖组成的[10]，由此可以推断出组成石斛水溶性多糖的单糖成分是多元化的，决定了各种石斛的药理作用的差异。4 讨 论关于石斛多糖含量测定，前人有一些研究报告。刘宏源等[7]对5批野生种源的经人工培植的铁皮石斛含量进行测定，结果为17.76%～29.19%。孙卓然等[11]对几种不同石斛多糖含量测定结果为：8.27%～28.28%。而笔者测定的结果为20.23%～44.43%。不同实验结果测得石斛多糖含量存在差异的原因，除了不同地区的石斛药材确实存在着化学成分的差异外，石斛的不同生长状况、不同采收期及采样的代表性等问题也是造成不同石斛多糖含量不一的原因。2010年版《中华人民共和国药典》规定：铁皮石斛按干燥品计算，含铁皮石斛多糖以无水葡萄糖（C6H12O6）计，不得少于25.0%，含甘露糖应为13.0％～38.0％，甘露糖峰面积与葡萄糖峰面积的比值应为2.4～8.0。表2数据显示，铁皮石斛的多糖和甘露糖含量均符合药典规定，而伪品也基本上符合药典规定。本实验所测的石斛中，铁皮石斛和伪品含糖量高低并无一定的规律，不能以此单独作为评价石斛质量优劣的指标。因此我们应结合其它技术手段，如分子生物学鉴定、薄层分析、显微鉴定或HPLC等，将品种研究、药效物质基础研究与质量标准研究相结合，才能制定出合理、科学的质量评价标准，从而避免商品石斛“鱼龙混杂”的局面，提高行业整体的质量水平。参考文献［1］ 李满飞, 徐国钧,徐珞珊,等. 商品石斛的调查及鉴定(Ⅱ)[J]. 中草药, 1991, 22(4): 173-180.[2] 朱艳, 秦民坚. 铁皮石斛茎段诱导丛生芽的研究[J]. 中国野生植物资源, 2003, 22(2): 56-57.［3］ 黄民权, 蔡体育, 刘庆伦. 铁皮石解多糖对小白鼠白细胞数和淋巴细胞移动抑制因子的影响［J］.天然产物研究与开发,1996,8(3):39-41.［4］ 吕圭源, 陈素红, 张丽丹,等. 铁皮石斛对小鼠慢性酒精性肝损伤模型血清2种转氨酶及胆固醇的影响［J］. 中国实验方剂学杂志,2010,16(6):192-193.［5］ 汤小华, 陈素红, 吕圭源, 等. 铁皮石斛对小鼠急性酒精性肝损伤模型SOD、MDA、GSH2Px 的影响［J］. 浙江中医杂志,2010,45(5):369-370.[6] 陈蕤. 石斛多糖提取工艺的研究[J]. 中国医药导报,2010, 7(12):40-43.[7] 刘宏源, 杨金燕,黄松,等. 3,5―二硝基水杨酸法测定铁皮石斛中多糖的含量[J]. 亚太传统医药,2010,6(8):14-16.[8] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典：1部[S] . 北京:中国医药科技出版社, 2010 : 265-266.[9] 陈晓梅. 石斛属植物化学成分和药理作用的研究进展[J]. 天然产物研究与开发,2000,13 (1) : 70-75.[10] 黄民权, 阮金月. 6种石斛属植物水溶性多糖的单糖组分分析[J]. 中国中药杂志,1997,22(2):114-115.[11] 孙卓然,刘园,李晓云，等. 石斛不同种、不同药用部位中多糖含量测定[J]. 时珍国医国药,2009,20(8):1886-1888.
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铁皮石斛与市场上常见的几种伪品含糖量的测定
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