中药化学相关知识（四）——植物组织培养及其在中草药研究中的运用

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植物组织培养是用无菌培养法培养植物的离体部分，即把从自然环境中分离出来的植物细胞或组织放入装有合成培养基的瓶中，使其在无菌条件下生长或发育的方法。这项工作的自动控制自20世纪50年代后期以来取得了很大进展，如诱导栽培胡萝卜的体细胞分化成完整植株，曼陀罗花药培养形成单倍体植株等。
这样就证明了植物的每一个体细胞都有形成整株植物的潜力。比如植物细胞具有“全能性”，在体外培养的一定条件下，可以诱导其分化器官，再生植株。20世纪70年代以后，植物原生质体培养和体细胞杂交的研究取得了很大进展。例如，烟草、曼陀罗、颠茄、胡萝卜、油菜等。可以从它们的原生质长成胚胎或完整的植物。烟草属和矮牵牛属的杂种细胞可以通过原生质体融合增殖并分化成杂种植株。
因此，可以用组织培养的方法来研究细胞、组织或器官在相对简单易行的观察条件下的繁殖、生长和分化，以及各种外界因素对它们的影响，从而为解决农业生产和医药生产中的一些问题开辟了广阔的前景。目前，一些重要成果已应用于生产实践。一种是无性繁殖系的快速繁殖。比如以甘蔗为例，以前每亩用0.5 ~ 1吨甘蔗种子。再比如贝母的繁殖率很低，组织培养三个月左右分化出的鳞茎就相当于种子繁殖的二年生鳞茎，另一种是医药和生物制品的工业化生产。药用植物的有效成分一般是从植物中提取的，其产量和质量不可避免地受到植物遗传、生长条件、采收期、贮运等因素的影响。如果可以通过培养微生物生产抗生素的类似方法来生产有效成分，就可以克服这些缺点。例如，近年来，大量培养人参组织并提取有效成分。因此，利用组织培养生产药用成分，探索天然药物生产的产业化道路，是药物生产的新方向。随着大规模人工培养技术的成功，用组织培养代替整株植物提取有效成分成为可能。这项工作将是未来植物药研究的中心课题之一。
培养基的组成及制备方法培养条件
材料及方法有效成分的形成
一、培养基的组成及制备方法
近年来使用的化学合成培养基大致由六种成分组成:(1)糖类，(2)各种无机盐，(3)微量元素，(4)氨基酸、酰胺类、酰胺类。③生长素。此外，一些培养基中还可以添加天然果汁，如椰子水、酵母提取物、水解酪蛋白、麦芽提取物等。如果培养基中添加0.5-1%琼脂，则为静态培养的固体培养基，否则为悬浮培养的液体培养基。不同的植物材料经常需要改变配方。比如维持生长和诱导细胞分裂分化的培养基配方就不一样，所以有很多种配方。目前最常用的基本培养基是Ms (Murashige和Skoog)培养基配方，有利于一般植物组织和细胞的快速生长。
总之，在进行组织培养研究时，要根据研究目的和培养植物的种类来确定培养基的成分。除了营养和诱导，还要注意离子平衡和毒性。比如水一般用蒸馏水，无机盐一般用化学纯药物。
可以用1N KoH(或NaOH)溶液和2N HCI调节pH值。有时可以用普通药物代替，但要注意这些药物不仅要有营养价值，还要无毒。如果在工业上用深槽培养细胞或组织来生产有效成分和生物制品，应用的培养基量会用吨位来衡量，那么用什么替代品更经济实用就要慎重考虑了。
二。培养条件
(一)温度:20 ~ 28℃能满足大多数植物组织的生长要求，其中26 ~ 27℃最适宜。
(二)光照:
组织培养通常在散射光下进行。光线的影响会导致不同的结果。一些植物组织在黑暗中生长良好，而另一些则在光照下生长良好。而愈伤组织分化成器官时，每天需要一定的光照才能形成芽和根。一些次生物质的形成仅由三个因素决定。
(三)渗透压:
渗透压与植物组织的生长和分化密切相关。渗透压可以通过在培养基中加入盐、蔗糖、甘露醇和乙二醇来调节。通常1 ~ 2个大气压就能促进植物组织的生长。当大气压高于2个大气压时，就会出现生长障碍。当大气压高于6个大气压时，植物组织不能存活。
(4) pH值:一般植物组织生长最适宜的pH值为5 ~ 6.5。在培养过程中，pH值会发生变化，添加磷酸氢盐或二氢盐可以起到稳定作用。
(五)通气:
悬浮培养中细胞的旺盛生长必须有良好的通气条件。少量的悬浮培养物经常旋转或振荡，可以起到曝气和搅拌的作用。在大量培养中可以使用特殊的通气和搅拌装置。
三。材料和方法
高等植物的所有种类和部位，从低等藻类到苔藓、蕨类植物和种子植物，都可以作为组织培养材料。一般子代植物多采用幼苗、芽和韧皮部细胞，被子植物多采用胚、胚乳、子叶、幼苗、茎尖、根、茎、叶、花药和被子植物。
由于植物表面在自然条件下经常受到霉菌和细菌的污染，因此必须对材料进行消毒。一般用漂白粉溶液(1 ~ 10%)、次氯酸钠溶液(0.5 ~ 10%)、氯化汞溶液(0.01%)、乙醇(70%)或双氧水(3 ~ 10%)进行处理，然后用无菌水反复冲洗组织，直至干净为止。然后，在无菌室中，将获得的组织在固体培养基上快速培养。在合适的条件下，去分化的组织块，称为愈伤组织，可以很快在受伤组织的切面上生长。这种愈伤组织在合适的培养基上经过一定时间后可以被诱导生长成完整的植株，因此愈伤组织不仅是某些植物代谢产物的来源，也是植物诱导的主要途径之一。
在适宜的培养条件下，愈伤组织可以长期继代培养，称为继代培养。但在继代培养中，随着继代代数的增加，许多植物培养的组织或细胞的分化能力逐渐降低甚至丧失。原因可能是原母体内存在的与器官形成有关的特殊物质在继代培养过程中被逐渐消耗，因此可以通过使用激素或改善营养条件来恢复。也有人认为，组织和细胞在长期培养中的遗传变化，主要是染色体的变化，导致了大量的多倍体或非整倍体细胞。这种变化可能会恢复。不同的培养基可以使愈伤组织以不同的速度生长，其结构可以是松散的，也可以是紧密的。利用这些特性，它可以分散成单个细胞或小细胞团。要形成单细胞，要在高盐度、高生长素、高水解酪蛋白的培养基中进行培养，然后移入液体中搅拌分散成单细胞。加入一些果胶酶也是有用的，但一般来说，很少能获得纯的单细胞。
在选择栽培药用植物的材料时，还要考虑所需次生代谢产物在植物中的合成位置。如果选材和培养方法得当，原植物中产生的主要代谢产物可以通过细胞或组织培养进行生化转化获得。
通过组织培养可以获得活性成分，但实际上只有大量成功培养才有经济价值。因此，生产中常采用悬浮培养代替含琼脂的固体培养基。悬浮培养的愈伤组织通常比静止培养的生长快。这是因为营养物质可以很快渗入细胞，抑制生长的代谢废物可以很快清除，供氧也更好。在此培养过程中，应注意通气和定期更新营养液，这是保证次生生物量稳定生长和高产的关键之一。
四。活性成分的形成
列举一些组织培养合成的活性成分。
利用组织培养生产药用成分逐渐成为药物生产的新方向之一。自20世纪60年代以来，一些国家对薯蓣属和其他相关科属进行组织培养，研究薯蓣皂苷元的形成，探索其生物合成机制。已知7种薯蓣属植物经组织培养后可获得薯蓣皂苷元或其他甾体化合物，其中三角叶薯蓣Wal1。通过组织培养获得的薯蓣皂苷元含量为0.3 ~ 2.5%。除此之外，还有鱼藤酮、甘草甜素、尼古丁等。例如，烟草根尖细胞悬浮培养可产生2.9%(干重)的尼古丁。
在常用的基础培养基中适当添加生长激素、维生素或其他化学物质，有时可以增加代谢产物。例如，在培养曼陀罗时，在培养基中添加0.1%的酪氨酸，可以使阿托品的产量增加7倍以上。芸香科培养时，在培养基中添加4-羟基-2羟基喹啉可以促进白鲜碱的合成和积累。在这两种情况下，添加剂被认为是生物合成的前体。再如三七愈伤组织培养时，生长后期补充1my/1激动素，东莨菪碱含量可达0.495%，远高于原植株。
除了培养基的成分外，环境因素也影响次生生物量的产生。例如，虽然附生植物的组织培养在黑暗中增殖，但不形成黄酮类化合物，但在光照下，可以检测到芹菜素。虽然组织培养在药学中的应用历史很短，但发展很快。它具有以下优点:
1。用组织培养代替原植物培养来获得所需的有效成分，可以达到高产低成本的目的，还可以节约土地。
2。除了生产次级生物质，它还可以应用于生物转化。例如，在烟草组织培养中，在蒂巴因去甲基化后可以产生吗啡。
3。从组织培养的定性分析中发现了新的化合物。比如芸香科的组织培养中合成并积累了芦丁，这是一种从原植物或其他植物的呋喃糖中没有检测到的化合物。因此，组织培养将成为新的生物活性化合物的来源。
4。一般组织培养都是异养的，但也有自养的细胞系，具有光合作用的能力，不依赖外界供糖。这一特点将使细胞培养技术优于整株，更经济。
目前国内相关单位已经成功产业化了麦角菌、灵芝、猴头菇等真菌，高等植物组织培养在产业化中的应用也在研究中。总之，植物组织培养这一新技术在中草药的应用中有着无限广阔的前景。它不仅有利于讨论和阐明药用植物的生理学、遗传学和成分生物合成等一系列理论问题，而且一旦工业化生产问题得到解决，将为疾病的预防和治疗做出巨大贡献。