仪器分析——层析技术二、层析法实验技术

(1)凝胶色谱法

凝胶色谱也称分子筛过滤、排阻色谱等。其突出的优点是色谱所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件温和，可在较宽的温度范围内进行，不需要有机溶剂，在保持被分离组分的物理化学性质方面有独到之处。对高分子物质有很好的分离效果。

⑷凝胶的选择根据不同的实验目的选择不同类型的凝胶。如果实验的目的是分离样品中的大分子物质和小分子物质，由于它们在分配系数上的显著差异，这种分离也称为组分离。一般可使用SephadexG-25和G-50，SephadexG-10、G-15和Bio-Gel-p-2或4可用于小肽和低分子量物质(1000-5000)的脱盐。一般选择排阻限略大于样品中物质分子量的凝胶。在色谱过程中，这些物质可以不同程度地渗透到凝胶中。因为Kd不一样，最后还是分开了。

⑷柱的直径和长度根据经验，2-30cm长的色谱柱多用于基团分离，分类分离一般需要100cm长的色谱柱。柱的直径在1-5厘米的范围内。小于1cm会出现管壁效应，大于5cm稀释现象严重。长度与直径D的比值L/D通常为7-10，但对于移动缓慢的材料，该比值为30-40。

3.凝胶柱的制备凝胶模型选定后，将干凝胶颗粒悬浮于5-10倍的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀后倒出微小颗粒。自然溶胀需要较长时间，加热可以加速溶胀，即在沸水浴中将湿凝胶浆料逐渐加热至接近沸腾，1-2小时即可使凝胶充分溶胀溶解。加热可以节省时间，还可以消毒。

凝胶填充:将色谱柱垂直固定在架子上的地面上，用夹子夹住下端的出口，在柱的顶部安装一个带有搅拌装置的大容器。该柱填充有洗脱剂。将凝胶制成较稀的浆液，放入柱子顶部的容器中，然后在轻微搅拌下使凝胶在柱子中下沉，这样凝胶颗粒就会上升到所需的高度。取下柱顶装置，用相应的滤纸轻轻覆盖凝胶床表面。放置一段时间，然后开始流量平衡。流速应低于色谱所需的流速。在平衡过程中逐渐增加流速至色谱，决不能超过最终流速。过夜平衡凝胶床。使用前检查色谱床是否均匀，是否有“线条”或气泡，或加入一些有色物质观察色带的运动。如果色带窄而均匀，说明色谱柱的性能好。当色带变形、散开或变宽时，必须重新加载。

⑷凝胶床平衡后，在床的顶部留下几毫升洗脱液使凝胶床饱和，然后用滴管加入样品。一般来说，样品体积不超过总凝胶床体积的5%-10%。样品的浓度与分配系数无关，因此可以增加样品的浓度。而分子量较大的溶液粘度会随着浓度的增加而增加，限制了分子的运动。因此，样品和洗脱液之间的相对粘度不应超过1.5-2。添加样品后，打开出口，让样品渗入凝胶床。当样品液面刚好与凝胶床表面处于同一水平时，加入几毫升洗脱液冲洗管壁，然后储存色谱床和洗脱液。

⑷凝胶柱的重复使用、凝胶回收和保存可在一次装柱后重复使用，无需特殊处理，不影响分离效果。为防止凝胶污染，可在第一次层析后加入0.02%叠氮化钠，并在下一次层析前除去抑菌剂，以免干扰洗脱液的测定。

如果不再使用，可以回收。一般的方法是将凝胶用水洗涤后滤出，然后依次用70%、90%、95%的乙醇脱水，直至乙醇浓度达到90%以上，滤出，再用乙醚洗去乙醇，滤出后干燥保存。湿保存法是在凝胶浆中加入抑菌剂或水，冲洗至中性，密封，高压灭菌。

凝胶色谱的应用

⑵脱盐:聚合物中的低分子量杂质(如蛋白质、核酸、多糖等。)溶液可以通过凝胶色谱法除去。这种操作叫做脱盐。该方法的脱盐操作简单、快速，且蛋白质和酶在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶是SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱长径比为5-15，样品体积可达柱床体积的25%-30%。为了防止脱盐后蛋白质溶解度降低导致沉淀吸附在柱上，一般用乙酸铵等挥发性盐缓冲液平衡色谱柱，然后加样，再加样。

⑵分离纯化:凝胶色谱已广泛应用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离纯化。该凝胶对热原有很强的吸附能力，可用于去除去离子水中的热原，制备注射用水。

⑵大分子物质分子量的测定:将一系列已知分子量的标准物质放入同一凝胶柱中，在相同条件下进行层析，记录每分钟组分的洗脱体积，将洗脱体积对分子量的对数作图，得到一定分子量范围内的直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将样品加入测定标准曲线的凝胶柱中，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出其分子量。

⑶聚合物溶液的浓度:一般将SephadexG-25或50干凝胶放入稀聚合物溶液中。此时，水和低分子量物质将进入凝胶颗粒内部的孔隙，而聚合物物质将被排除在凝胶颗粒之外。然后，将通过离心或过滤分离溶胀的凝胶，并获得浓缩的聚合物溶液。

(2)离子交换色谱法

离子交换色谱是利用具有离子交换性质的物质作为固定相，在流动相中利用其与离子能量的可逆交换性质来分离离子化合物的方法。

⑷离子交换器的预处理和装柱。对于离子交换纤维素，少量不易沉淀的破碎颗粒要用流水冲洗掉，以保证良好的均匀性。对于膨胀的产品，这一步是不必要的。溶胀的交换剂在使用前应先用稀酸或稀碱处理，使其成为含H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂通常经过“碱-酸-碱”处理，最终变成-OH-型或盐型交换剂；阳离子交换剂经过“酸-碱-酸”处理，最后转化为-H型交换剂。使用前，洗涤过的纤维素必须平衡到所需的pH值和离子强度。在装载色谱柱之前，应对平衡交换器进行减压，以去除气泡。为了防止不同粒径的交换剂在自然沉降过程中分层，需要对柱进行适当的加压和装填，同时使柱床密实以减少死体积，有利于分离度的提高。色谱柱安装后，可以用初始缓冲液冲洗，直到达到完全平衡。

⑷加样和洗脱加样:用于层析的样品应具有与初始缓冲液相同的pH值和离子强度，所选pH值应落在交换剂和缀合物带相反电荷的范围内。同时，应该注意的是，离子强度应该较低。透析、凝胶过滤或稀释可用于实现这一目的。应在透析后或凝胶过滤前通过离心去除样品中的不溶物。为了达到满意的分离效果，装填量应适当，不超过柱的负荷能力。通过交换容量可以计算出塔的负荷量，负荷量通常为交换器总交换量的1%-5%。

洗脱:在结合样品进行离子交换之前，可以通过改变溶液的pH值或离子强度来洗脱结合物，也可以同时改变pH值和离子强度。为了完全分离复杂的组分，通常需要逐渐改变pH值或离子强度。最简单的方法是相洗脱法，即分几次加入不同pH和离子强度的溶液，逐步洗脱不同的组分。由于洗脱pH和离子强度变化较大，同时洗脱出许多洗脱体积相近的组分，纯度较差，不适合精细分离。洗脱方法为连续梯度洗脱。洗脱装置如图16-6所示。两个容器放在同一水平面上。第一个容器装有一定pH值的缓冲液，第二个容器装有高盐浓度或不同pH值的缓冲液。两个容器相连，第一个容器与柱子相连。当溶液从第一个容器流入色谱柱时，第二个容器中的溶液会自动补充，搅拌后再与第一个容器中的溶液混合，使缓冲液流入色谱柱。任何时候第一个容器中的浓度可以通过以下公式计算:

C=C2-(C2-C1)(1-V)A2/A1

其中A1和A2分别代表两个容器的横截面积；C1和C2分别代表容器中溶液的浓度；v是流出体积与总体积的比率。a1 = a2时为线性梯度，a1 > a2时为凹梯度，a1 > a2时为凸梯度。

洗脱时应满足以下要求:①洗脱液的体积要足够大，通常是床体积的几十倍，这样分离出来的峰不会太拥挤。②梯度的上限应足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱。(3)梯度不应上升过快，移动区应在柱端解吸。目标的过早解吸将导致区域扩散；但靶的后期解吸会使峰形过宽。

⑶洗脱液馏分的分析收集一定体积(5-10ml/管)的洗脱液，可逐管测定，得到色谱图。根据不同的实验目的，采用适当的检测方法(生物测定法、免疫学测定法等。)可用于确定目标在图谱中的位置并恢复目标。

⑷离子交换器的再生和保存。离子交换剂可以在柱子上再生。比如离子交换纤维素可以用2 mol/:NaCl洗，如果有强吸附质，可以用0.1mol/LNaOH洗柱。如有脂溶性物质，可用非离子型洗涤剂洗柱，或用乙醇洗，顺序为0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20% NaOH-水。保存离子交换剂时应添加防腐剂。阴离子交换剂宜用0.002%氯己定(氯己定)，阳离子交换剂宜用乙基硫柳汞(0.005%)。有些产品含有0.02%的叠氮化钠。

⑷离子交换色谱的应用离子交换色谱技术已经广泛应用于各个学科。主要用于生化和临床生化检验中分离氨基酸、肽和蛋白质。它还可以用于分离核酸、核苷酸和其他带电生物分子。